Диссертация (1144700), страница 22
Текст из файла (страница 22)
В этот список входят белки Gas1,Tif1, Ecm33, Rim1, Toh1, Plb1, Gas5, Gas3, Ape1, Ilv2, Ira1, Utp20, YBL100W-B иMlp1. Белки Gas3, Gas5, Ecm33 и Toh1, также как и Gas1, являются белкамиклеточной стенки [Nuoffer et al., 1991; Rolli et al., 2010; Terashima et al., 2003;Hamada et al., 1998]. Особый интерес представляет белок Toh1. Продукция этогобелка резко усиливается при повреждениях клеточной стенки, а также приостановке клеточных делений [García et al., 2004; Tkach et al., 2012]. Можнопредположить, что формирование амилоидных фибрилл белка Toh1 в клеточнойстенке помогает клетке пережить стресс.Для оценки агрегации одного из выявленных кандидатов на рольфункциональных амилоидов проведены дополнительные эксперименты.
Мысконструировали плазмиду PGPD1-GAS1-YFP, содержащую химерный ген GAS1YFP, под контролем промотора GPD1. При трансформации штамма BY47-42плазмидойPGPD1-GAS1-YFPбелокGas1-YFPобразуетцитологическидетектируемые агрегаты (рис. 20А). Более того, в штамме ATCC 201388 GAS1YFP, содержащем химерный ген GAS1-YFP под контролем промотора GAS1,также детектируются агрегаты, которые локализуются в основном по периферииклеток и, возможно, входят в состав клеточной стенки (рис.
20А). Агрегаты Gas1YFP демонстрируют устойчивость к обработке 1% SDS (рис.20 Б).136Рисунок 20. Агрегация белка Gas1-YFP в клетках штамма BY4742. А –Выявление с помощью флуоресцентной микроскопии агрегатов белка Gas1-YFP,продуцирующегося под контролем промоторов GPD1 и GAS1. Б – ВыявлениеSDS-устойчивых полимеров белка Gas1-YFP методом полуденатурирующегоэлектрофореза и Вестерн-блот гибридизации с использованием антител 11E5,специфичных к YFP, GFP и CFP. Цифрами обозначены номера дорожек.
1 –денатурированный белок Gas1-YFP; 2- неденатурированный белок YFP; 3- SDSустойчивые полимеры неденатурированного белка Gas1-YFP, продуцирующегосяпод контролем промотора GPD1.Эти данные подтверждают гипотезу, согласно которой белок Gas1 образуетконститутивные амилоидные агрегаты in vivo.
Для окончательного заключения вперспективе необходимо в экспериментах in vitro оценить способность белка Gas1формироватьфибриллы,которыеокрашиваютсяамилоид-специфическимикрасителями. В представленной работе мы выявляем кандидатов на рольфункциональных дрожжевых амилоидов, но не ставим задачу доказатьамилоидные свойства выявленных кандидатов.137В целом, полученные результаты позволяют заключить, что разработанныйметод может быть успешно использован для протеомного скрининга иидентификации белков, формирующих прионные агрегаты.
Минорный белокRnq1 (не более 1140 молекул на клетку) [Ghaemmaghami et al., 2003; Chong et al.,2015],уверенноидентифицируетсядажеприиспользованиинаименеечувствительного варианта методики, включающей двумерный электрофорез.МодификацияметодикиPSIA,включающаяHPLC-MALDI,наиболееинформативна и может дать преимущества при идентификации неизвестныхприонных детерминантов, таких как [NSI+]. Большое количество ложнопозитивных сигналов, соответствующих, например, белкам рибосомы, легкоотсекается за счѐт сравнения списка белков, выявленных в прионном штамме иего деривате, полученном в результате пассирования клеток на среде с GuHCl.3.2.2.
Идентификация прионов и неинфекционных амилоидов в штамме[NSI+]3.2.2.1. Идентификациябелков,формирующихдетергент-устойчивыеагрегаты в штамме [NSI+]Мы использовали метод PSIA HPLC-MALDI для выявления белков,которые могут являться детерминантами прионного фактора [NSI+].
Фракциябелков, формирующих агрегаты, устойчивые к инкубации с 1% SDS, былаполучена из культур штаммов 1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-], как описано вразделе «Материалы и методы». Белковые агрегаты растворяли в муравьинойкислоте, высушивали, денатурировали кипячением и очищали от детергентов.После трипсинолиза пептиды разделяли методом HPLC и идентифицировали спомощью масс-спектрометрии. Эксперимент проведѐн в двух независимыхповторностях. В таблице 18 представлены в алфавитном порядке белки,идентифицированные в штамме [NSI+] со счѐтом, превышающим 50 условныхединиц в обеих повторностях. Единственное исключение составляет Swi1,138который идентифицирован лишь в одном эксперименте.
Это исключение сделано,исходя из того, что Swi1 - один из самых минорных белков в дрожжевомпротеоме (примерно 120 молекул на клетку) [Chong et al., 2015], но в то же времяэтот белок является детерминантом приона [SWI+] [Du et al., 2008; Crow et al.,2008].Можнопредположить,чтоSwi1детектируетсянапределечувствительности метода PSIA HPLC-MALDI. Из таблицы исключены всерибосомные белки, которые выявляются во фракции детергент-устойчивыхагрегатов, как в штамме [NSI+], так и [nsi-].Ряд белков, выявленных нами ранее в качестве кандидатов на рольфункциональных дрожжевых амилоидов (см. таблицу 17), был идентифицировантакже в штаммах [NSI+] и [nsi-]. К этому списку относятся белки Gas1, Gas5, Rim1,Toh1 и Ape1.
Отметим, что здесь указаны лишь те белки, которые с высокимсчѐтом выявлялись в штаммах [NSI+] и [nsi-] в двух независимых повторностях.Полученные данные свидетельствуют о том, что присутствие этих белков вофракции детергент-устойчивых амилоидов не является штаммоспецифичнойособенностью. Во фракции SDS-устойчивых агрегатов в штаммах [NSI+] и [nsi-]также выявлен белок Bgl2, который, как было показано ранее, образуетамилоидные полимеры в клеточной стенке дрожжей [Kalebina et al., 2008]. Вкачестве потенциального амилоида интересно рассмотреть белок клеточнойстенки Ygp1, который идентифицирован методом PSIA HPLC-MALDI в штаммах[NSI+] и [nsi-].
Продукция Ygp1 активируется при остановке клеточных делений,вызванной недостатком питательных веществ, и этот белок секретируется вовнешнюю среду, способствуя формированию биоплѐнки [Destruelle et al., 1994].Учитывая функции Ygp1 и его способность формировать SDS-устойчивыеагрегаты, можно полагать, что этот белок образует функциональные амилоидныеагрегаты в стессовых условиях.
Как было сказано в главе «Обзор литературы», вформировании биоплѐнки бактерий важную роль играют амилоиды. Вполневозможно, это справедливо и для S. cerevisiae.139Таблица 18. Белки, формирующие SDS-устойчивые агрегаты , в штаммах1-1-D931 [NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-], идентифицированные методом PSIA HPLCMALDIБелокAct1Adh1Ape1Bgl2Cyc1Ape4Tef1EFT1Eno2Fas1Nop1Gas1Gas5Ssb1Mit1*Nsr1Rim1Rnq1*Sis1*Swi1*Ygp1Toh1Примечания:Счѐт массИдентифицирован Идентифицированспектрометрии, в штамме [NSI+]в штамме [nsi-]отражающийдостоверностьидентификации181605533331091462962398011941973911742236163051046014365111140+++++++++++++++++++++++++++++-+++++++-++++1Счѐт – показатель, отражающий достоверность идентификации белка всоответствии с базой данных «MASCOT».
Указан счѐт, с которым былиидентифицированы белки в образце из штамма 1-1-D931 [NSI+].*Белок выявляется и идентифицируется только в штамме 1-1-D931 [NSI+].140Белки Rnq1, Swi1, Mit1 и Sis1 были идентифицированы только в штамме[NSI+], но не в контрольном штамме [nsi-] (табл. 18). Белки Rnq1 и Swi1 являютсядетерминантами прионов [PIN+] и [SWI+], соответственно [Derkatch et al., 2001;Due et al., 2008]. Mit1 входит в список потенциально прионогенных белков,поскольку содержит Q/N-обогащѐнную последовательность [Harrison and Gerstein2003].
Шаперон Sis1 связывает неправильно уложенные белки и транспортируетих в ядро для деградации. Показано, что данный шаперон взаимодействует сразличными дрожжевыми прионами [по: Higurashi et al., 2008]. В частности, мыпоказали, что шаперон Sis1 выявляется методом PSIA HPLC-MALDI в штамме[PIN+][PSI+] (таблица 17). Основываясь на этих данных, можно исключить белокSis1 из списка кандидатов на роль детерминанта фактора [NSI+].
Таким образом,белки Rnq1, Swi1 и Mit1 являются кандидатами на роль детерминанта фактора[NSI+].1413.2.2.2. Выявление белков-детерминантов фактора [NSI+]С помощью метода PSIA были выявлены белки Rnq1, Swi1 и Mit1, которыеприсутствуют во фракции детергент-устойчивых агрегатов в образцах из штамма[NSI+], но отсутствуют в образцах [nsi-] (табл. 18). Мы провели сравнительныйанализ агрегации белков Rnq1-CFP, Swi1-YFP и Mit1-GFP в штаммах [NSI+] и[nsi-] с помощью Вестерн-блот гибридизации.Методом полуденатурирующего электрофореза мы показали, что SDSустойчивые агрегаты Rnq1-CFP выявляются в штамме [NSI+], но не [nsi-] (рисунок21А). Агрегация Swi1-YFP в штамме [NSI+] и отсутствие агрегатов этого белка вштамме[nsi-]былопоказаноспомощьюметодадифференциальногоцентрифугирования (рисунок 21Б).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
