Диссертация (1144700), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Счѐтпревышающий 50 условных единиц как правило свидетельствует о достовернойидентификации белка на 5% уровне значимости (p<0.05).2.8.2.3. Жидкостная хроматография, совмещенная с масс-спектрометрией(HPLC-MALDI)Удаление детергентов и обессоливание проб проводили при помощиколонок HiPPR Detergent Removal column (Thermo Scientific) и Zeba Desaltingcolumn (Thermo Scientific), соответственно, согласно протоколу производителя.
Кполученным пробам (50 мкл, концентрация тотального белка 0,2 мг/мл)добавляли 1 мкл свежеприготовленного раствора 50 мМ дитиотрейтола в 50 мМбикарбонате аммония, инкубировали 15 минут при 50°С, после чего добавляли 1мкл 100 мМ раствора йодацетамида в 50 мМ бикарбонате аммония иинкубировали пробу в течение 15 мин., 20°С в темноте. Далее к пробам добавляли1 мкл дитиотрейтола для инактивации йодацетамида, 5 мкл трипсина (10 нг/мкл,Sigma)ипроводилиинкубациюпри37°Свтечениеночи.Трипсин102инактивировали добавлением 0,5 мкл 10% раствора трифторуксусной кислоты,после чего проводили центрифугирование в течение 30 мин. (20000 g, 4°С).Полученные смеси пептидов наносили (1 мкл) на обратнофазовую колонку дляHPLC Acclaim™ PepMap 300 (150 мм × 75 мкм, размер частиц 5 мкм, ThermoScientific) и разделяли в градиенте ацетонитрила (2-90%) в течение 45 мин.
навысокоэффективном нанопоточном жидкостном хроматографе UltiMate 3000UHPLC+ RSLCnano (Dionex). Фракции пептидов наносили на 384-луночнуюподложкуMTPAnchorChip™800/384(BrukerDaltonics)спомощьюавтоматического коллектора фракций «Proteineer fc II» (Bruker Daltonics) черезкаждые 10 с. В качестве матрицы была использована α-циано-4-гидроксикоричнаякислота. В качестве стандартов использовали Peptide calibration standard II8222570(BrukerDaltonics).Идентификациюпроводилинаприборе Ultraflextrime (Bruker Daltonics). Для каждой фракции определяли MSспектр.
Полученные спектры анализируются при помощи программногообеспечения WARP-LC с учетом того, что они получены в результате жидкостнойхроматографии.Программаопределяетнаборуникальныхпептидов,характеризующихся задержкой, зарядом и молекулярной массой. Для этихпептидов проводили MS/MS в тех фракциях, где концентрация (интенсивностьпика) этих пептидов максимальна. Соответствие полученных спектров белкамопределялось при помощи программного обеспечения Mascot версии 2.4.2.Показатель«счѐтмасс-спектрометрии»,отражающийдостоверностьидентификации белка, определялся как описано в разделе 2.8.2.2.2.9.Статистические методыВычисления стандартного отклонения, ошибки среднего, а также сравнениевыборок при помощи непараметрического критерия Манна-Уитни проводили припомощи пакета программного обеспечения “STATISTICA” версии 6.0.
(“StatSoftInc.”, США).1033.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1.Прионный фактор [NSI+]3.1.1. Выявлениеихарактеристикадрожжевогоэпигенетическогодетерминанта [NSI+]Эпигенетичесикй детерминант, вызывающий нонсенс-супрессию, был выявленпри работе с дрожжевым штаммом 1-D931 (таблица 4), маркированным нонсенсмутациями ade1-14 и trp1-289 и содержащем плазмиду pU-A-SUP35MC на фонеделеции хромосомной копии гена SUP35. Гибридный ген A-SUP35MC содержитпоследовательность, кодирующую амилоидный пептид бета человека, слитую врамке с последовательностью, кодирующей домены М и С белка Sup35.
Ген ASUP35MC находится под контролем промотора CUP1, который активируетсядобавлением ионов меди в питательную среду. Эффективность терминациитрансляции оценивали в соответствии с темпами роста штамма на среде безаденина и без триптофана, что отражает частоты ошибочного прочтения стопкодонов ade1-14(UGA) или trp1-289 (UAA), как значащих (рис.10 А и Б).Как видно из результатов, представленных на рисунке 10А, темпы росташтамма на среде без аденина закономерно снижаются при увеличенииконцентрации ионов меди в питательной среде, и, соответственно, с увеличениемуровня продукции гибридного белка A-Sup35MC.
Относительное количествобелка A-Sup35MC в клетках штамма 1-D931 при изменении концентрации ионовмеди в среде оценивали методом Вестерн-блот гибридизации с использованиеммоноклональных антител 4G8, специфичных к пептиду Аβ (рис. 10А). Придобавлении в среду 150 µМ сульфата меди штамм 1-D931 на среде без аденина ибез триптофана не растѐт (рис.10А и Б).104Рисунок 10. Характеристика нонсенс-супрессорного фенотипа штамма 1-D931 иего деривата 1-1-D931, которые продуцируют гибридный белок A-Sup35MC. АРост штамма 1-D931 на среде без аденина с добавлением сульфата меди вразличнойконцентрации.РезультатыВестерн-блотгибридизациисиспользованием антител 4G8 отражают изменение уровня продукции белка ASup35MC. Б – Рост штамма 1-1-D931 на средах без аденина и без триптофана сдобавлением 150 µМ сульфата меди до и после пассирования клеток на среде сGuHCl.
В – Сравнительный анализ количества белка A-Sup35MC в клеткахштаммов 1-D931 и 1-1-D931 методом Вестерн-блот гибридизации. Выравниваниеколичества тотального белка в обоих случая (1А и 1В) проводилось с помощьюметода Бредфорда [Bradford, 1976].В результате отбора индивидуальных колоний мы выявили один клон,обозначенный 1-1-D931, демонстрирующий нонсенс-супрессорный фенотип придобавлении в питательную среду даже 150 µМ сульфата меди (рис 10Б).Супрессия проявления нонсенс-мутаций ade1-14(UGA) и trp1-289 (UAG) не быласвязана с изменением уровня продукции гибридного белка A-Sup35MC (рис10В). Нонсенс-супрессорный фенотип стабильно наследовался в митозе и105элиминировался в результате пассирования клеток исследуемого штамма на средес 5mM хлоридом гуанидина (GuHCl) у 124 из 128 клеток (97%) (рис 10Б).Напомним, что GuHCl инактивирует АТФ-азную активность шаперона Hsp104 ивызывает элиминацию большинства известных дрожжевых прионов [Tuite et al.,1981;.
Derkatch et al., 1997; Wickner, 1994]. На основании этих фактов мызаключили, что нонсенс-супрессия в штамме 1-1-D931 детерминируетсяэпигенетическим фактором, который мы назвали [NSI+] (Nonsense SuppressionIducer). Штаммы, не содержащие этот фактор, были обозначены [nsi-].Анализ роста штаммов на средах с неферментируемыми источникамиуглерода показал, что наличие фактора [NSI+] ингибирует рост штаммов насредах, содержащих в качестве источника углерода галактозу или глицерин (рис.11).
Элиминация фактора [NSI+] в результате пассирования штамма на среде сGuHCl приводит к восстановлению нормальных темпов роста дрожжей на средахс неферментируемыми источниками углерода (рис. 11).Рисунок 11. Фактор [NSI+] вызывает нонсенс-супрессию и подавление роста насредах с неферментируемыми источниками углерода. Рост штаммов 1-1-D931[NSI+] и 1-1-1-D931 [nsi-] на средах MD без добавления аденина и триптофана, атакже на средах с галактозой (MG) и глицерином (MGly) в качестве источникауглерода.
Для экспрессии гибридного гена A-SUP35MC во все используемыесреды добавляли 150 μМ сульфата меди. Фотографии сделаны на третий деньинкубации дрожжей на селективных средах при 30oC.1063.1.2. Aβ-Sup35MC не является детерминантом фактора [NSI+]Пептид Аβ человека как в организме млекопитающих, так и при продукциив дрожжевых клетках, может формировать агрегаты [Bagriantsev and Liebman,2006; Porzoor and Macreadie, 2013]. Для проверки гипотезы, согласно которойфактор [NSI+] возник в результате прионной конверсии гибридного белка ASup35MC, мы провели сравнительный анализ агрегации этого белка в штаммах[NSI+] и [nsi-], используя метод дифференциального центрифугирования иВестерн-блот гибридизации.
Для экспрессии гибридного гена A-SUP35MC здесьи во всех дальнейших экспериментах во все используемые среды добавляли 150μМ сульфата меди. Как в штамме [NSI+], так и в штамме [nsi-] большая доля белкаA-Sup35MC представлена в растворимой надосадочной фракции (рис.12 А).Рисунок 12. Гибридный белок Aβ-Sup35MC не является детерминантом фактора[NSI+]. А – Сравнительный анализ количества белка Aβ-Sup35MC методомВестерн-блотгибридизациисиспользованиемантител“Anti-Sup35C”,распознающих последовательность Sup35MC.
Для выравнивания количестватотального белка использовался метод Бредфорда. Б – Рост дрожжей на среде безаденина в эксперименте с последовательной заменой плазмид в штамме [NSI+].Плазмиду pL-Ab-SUP35MC замещали на плазмиду pYCH-U2, а затем проводилиобратную замену плазмид.107Распределение белка между надосадочной и осадочной фракциями неразличается.
Таким образом, полученные результаты не подтверждают гипотезу отом, что возникновение фактора [NSI+] связано с прионной агрегацией ASup35MC.Как известно, делеция гена, кодирующего прионформирующий белок,неизбежно приводит к элиминации приона [Wickner et al., 1999]. Заменаплазмиды pL-Aβ-Sup35MC на центромерную плазмиду pYCH-U2, содержащуюгенSUP35подконтролемсобственногопромотора,вызвалапотерюсупрессорного фенотипа (рис. 12Б), однако обратная замена плазмиды pYCH-U2на pL-Aβ-Sup35MC привела к полному восстановлению супрессорного фенотипа(рис.
12Б). Данные, полученные в этом эксперименте доказывают, что потерягена, кодирующего белок Aβ-Sup35MC лишь маскирует проявление фактора[NSI+], но не вызывает его элиминации. На основании полученных результатовможно заключить, что гибридный белок Aβ-Sup35MC не является детерминантомфактора [NSI+].3.1.3. [NSI+] вызывает снижение эффективности терминации трансляцииПоскольку нонсенс-супрессию наблюдали в штаммах [NSI+] лишь на фонепродукции Aβ-Sup35MC, мы предположили, что гибридный белок даже присверхпродукции хуже выполняет функцию фактора терминации трансляции, чемнативный белок Sup35.
Для проверки этого предположения мы заменили вштаммах 4-1-1-D931[NSI+] и 1-1-D931[NSI+] плазмиды, кодирующие белок AβSup35MC, на следующие конструкции:1. Плазмида pFL38-SUP35P, кодирующая ген SUP35 P. methanolica;2. Плазмида pNR-ΔABF1, содержащая ген SUP35 с мутацией в промоторнойобласти, снижающей уровень экспрессии;1083.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
