Диссертация (1144700), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Генотипы приведены в соответствии со стандартной трехбуквенной номенклатурой [Захаров и др. 1984;Sherman et al., 1986]. Аллель ade1-14 содержит нонсенс-мутацию UGA; trp1-289 – нонсенс-мутацию UAG; ura3-52 –инсерцию дрожжевого мобильного элемента Ty1 в кодирующую часть гена URA3; leu2-3,112 – двойные мутации в генеLEU2.76Штамм3-1-1-D931былполученврезультатезамещенияпоследовательности хромосомных копий гена HSP104 в штамме 1-1-D931 напоследовательность гена LEU2. 1-D956 – гаплоидный сегрегант штамма D956,полученный с помощью случайной выборки аскоспор.Штаммы GT81-1C, GT409 и BY4742 были любезно предоставлены проф.Ю.О.
Черновым. 1-BY4742 – [pin-] дериват штамма BY4742. Штамм ATCC201388 GAS1-YFP, любезно предоставленный А.А. Александровым, содержитинтегрированную в хромосому последовательность гена GAS1 под контролемсобственного промотора, слитую в рамке с последовательностью гена GFP [Huhet al., 2003]. Штамм 7B-D901 [Saifitdinova et al., 2010] любезно предоставлен Ю.В.Соповой.Ниже указан способ получения диплоидных штаммов, используемых вработе:D933 (1-D931 MATa х 2-1-1-1-D931 MATα); D955 (1-1-D931 MATa х BY4749MATα); D934 (1P-74-D694 MATa x 6-1-1-D931 MATα); D935 (1-D934 MATa x 2D934 MATα); D936 получен в результате пассирования на среде с GuHCl штаммаD935; D932 (7B-D901 MATa x 2-1-1-1-D931 MATα); D956 получен в результатескрещивания штамма 4-1-1-D931 клоном BY4742 mit1Δ:: KanMX4 делеционнойдрожжевой библиотеки “BY deletion collection” (Invirtogene, США), созданной набазе штамма BY4742.
Клон BY4742 mit1Δ:: KanMX4 из делеционной библиотекилюбезно предоставлен проф. Ю.И. Павловым (Небраска, США).2.2. ПлазмидыПлазмида pcDNA3-1-3F4 содержит мышиный ген Prnp, модифицированныйдля распознавания моноклональными антителами 3F4, а также ориджины,необходимые для репликации плазмиды в E. coli и культурах клетокмлекопитающих [Narwa and Harris, 1999].77Все остальные плазмиды представляют собой челночные вектора, имеющиедрожжевыеибактериальныеориджинырепликации.Ихосновныехарактеристики представлены в таблице 5. Плазмида pRS315 была описана ранее[Christianson,etal.,1992].ПлазмидаpmCUPNMsGFPсодержитпоследовательность, кодирующую химерный ген под контролем индуцибельногопромотора CUP1 [Serio et al., 1999]. Плазмида pRS316CG, содержащаяпоследовательность гена GFP под контролем промотора CUP1, была описанаранее[LiuandLindquist,1999].ПлазмидаpRS315-SUP45,любезнопредоставленная проф.
Г.А. Журавлѐвой, была описана ранее [Moskalenko et al.,2003]. Плазмида pFL38-SUP35P, предоставленная И.Л. Деркач, содержитпоследовательность гена SUP35 Pichia methanolica [Derkatch et al., 2000].Плазмида pCUP1-RNQ1-CFP(LEU2) любезно предоставлена С.П. Задорским(СПбФ ИОГен РАН, Россия). Плазмида pNR-ΔABF1, несущая полноразмерныйSUP35 с делецией сайта связывания транскрипционного фактора Abf1p впромоторе, любезно предоставлена Н.А. Рябинковой. Плазмиды YEpHO [Jensen etal., 1983] и pRS315 [Sikorski and Hieter, 1989] были описана ранее.Мультикопийная плазмида pLH105 содержит ген HSP104 под контролемпромотора GPD [Vogel et al., 1995].
Плазмиды pRS315-SUP35MC и pRS316SUP35MC,любезнопредоставленныепроф.Ю.О.Черновым,содержатпоследовательность, кодирующую домены М и С белка Sup35 под контролемсобственного промотора. После промотора перед последовательностью SUP35MCвстроен полилинкер, содержащий сайты для эндонуклеаз рестрикции BamHI иSacI [Saifitdinova et al., 2010]. Плазмида pYCH-U2, любезно предоставленная И.Л.Деркач, содержит ген SUP35 под контролем собственного промотора [Derkatch etal., 1997].
Плазмиды pSP-YFP и pSP-CFP любезно предоставлены С.П.Задорским.Плазмида p426GPD–SWI1YFP, любезно предоставленная проф. Г.А. Журавлѐвой,была описана ранее [Du and Li, 2014]. Центромерная плазмида pID129,содержащая ген RNQ1 была описана ранее [Kadnar et al., 2010].78Плазмиды pDB691 (UGAC) и pDB690 (CGAC) любезно предоставлены М.Д.Тер-Аванесяном.Этиплазмидынесуттандемнорасположенныегены,кодирующие люциферазы коралла Renilla и жука-светлячка, разделенные стопкодоном UGA (pDB691) или значащим кодоном CGA (pDB690) [Keeling et al.,2006; Kallmeyer et al., 2006].Далее описаны плазмиды, сконструированные в ходе данной работы.Плазмида pmCUP1-SUP35MC была сконструирована следующим образом –фрагментXhoI-BamHI, содержащий последовательность промотора CUP1 изплазмиды pmCUP1 [Serio, et al. 1999] был встроен в вектор pRS425 [Labbe-Bois1990]. На следующем этапе последовательность SUP35MC, фланкированнаясайтами рестрикции BamHI-SacI, была встроена вслед за промотором CUP1[Saifitdinova et al., 2010].Плазмида pU-Aβ-SUP35MC [Цапонина и др., 2005] были сконструированыкак описано ниже.
Последовательность, кодирующая пептид Аβ (40 аминокислот)человека, была получена из тотальной РНК мозга абортуса при помощи методаRT-PCR (обратной полимеразной цепной реакции). Синтез кДНК проводился спомощью набора реактивов и согласно протоколу фирмы “Fermentas”. ПраймерысодержатсайтырестрикцииBamHIиSacI,стартовыйкодонАТГипоследовательности комплементарные 5’ и 3’ концам ДНК, кодирующей пептидАβ (таблица 6).Амплифицированная последовательность была секвенирована и встроена вплазмиду pmCUP1-SUP35MC по сайтам BamHIи SacI, расположенным вслед запромоторомCUP1.ЦентромернаяплазмидаpU-Aβ-SUP35MCсодержитпоследовательность Аβ-SUP35MC под контролем индуцибельного промотораCUP1, бактериальный и дрожжевой ориджины репликации и ген устойчивости кампициллину – AmpR и ген URA3.Для получения плазмиды pL-Aβ-SUP35MC, содержащей маркѐрный генLEU2, последовательность PCUP1-Aβ-SUP35MC из плазмиды pU-Aβ-SUP35MC,79фланкированная сайтами рестрикции XhoI-SacI, была встроена в вектор pFL36(Bonneaud, et al.
1991).PCUP1-GFP(URA3) – многокопийная плазмида, созданная на основе вектораpFL44S, содержит последовательность гена sGFP под контролем промотораCUP1, гены – ampR, URA3, бактериальный и дрожжевой ориджины репликации.Плазмида получена путѐм интеграции фрагмента XhoI-SacI из плазмидыpRS316CG, несущего последовательность гена GFP под контролем промотораCUP1, в вектор pFL44S, гидролизованный эндонуклеазами рестрикции XhoI иSacI.PGPD-GFP(URA3) [Рубель и др., 2008] – многокопийная плазмида, созданнаяна базе вектора pFL44S, содержит последовательность гена sGFP под контролемпромотора GPD, гены – ampR, URA3, бактериальный и дрожжевой ориджинырепликации.
Плазмида pGPD-GFP(LEU2) была получена за счѐт инсерциифрагмента плазмиды PGPD-GFP(URA3), содержащего последовательность PGPDGFP (SalI-SacI) в плазмиду pRS425 гидролизованную рестриктазами SalI и SacI.Плазмиды pGPD-YFP(URA3), pGPD-YFP(LEU2), pGPD-CFP(URA3) иpGPD-CFP(LEU2) были получены путѐм замены фрагмента 0.7-kb SacII-SacI ,кодирующего последовательность ген GFP в составе плазмид PGPD-GFP(URA3)иpGPD-GFP(LEU2),напоследовательностьгеновYFPиCFP.Последовательности YFP и CFP, были выделены из плазмид pSP-YFP и pSP-CFP,гидролизованных эндонуклеазами SacII и SacI.Плазмиды pGPD-PrP23-231-CFP(LEU2), pGPD-PrP28-231-CFP(LEU2) pGPDPrP90-231-CFP(LEU2)иpGPD-PrP110-231-CFP(LEU2)былисконструированыследующим образом – последовательности, кодирующие фрагменты белка PrPмыши PrP23-231, PrP28-231, PrP90-231 и PrP110-231, фланкированные сайтами рестрикцииBamHI и SacII , были интегрированы в вектор pGPD-CFP(LEU2) по тем же сайтам,расположенным вслед за промотором GPD.
Таким же образом, на базе вектораpGPD- YFP(URA3) была получена плазмида pGPD-PrP23-231-YFP(URA3). Цифрами80в названии плазмид обозначены номера первой и последней аминокислоты всоставе соответствующих фрагментов белка PrP мыши. Последовательностииспользованных праймеров приведены в таблице 6.Плазмиды pGPD-PrP23-231-GFP(URA3), PGPD- PrP90-231-GFP(URA3) и pGPDAβ-GFP(URA3) были получены за счѐт интеграции ПЦР фрагментов PrP23-231PrP90-231, и Aβ (40 аминокислот), фланкированных сайтами рестрикции BamHI иSacII в вектор pGPD-GFP(URA3).ПлазмидаpGPD-Aβ-YFP(URA3)последовательностипоследовательностьвGFPYFPизбылаполученаплазмидеплазмидызасчѐтзаменыPGPD-Aβ-GFP(URA3)pSP-YFP,нагидролизовованнойэндонуклеазами SacII и SacI.pU-VTS1 – мультикопийная плазмида содержит последовательность,кодирующую ген VTS1 под контролем индуцибельного промотора CUP1.Последовательность VTS1 была амплифицирована из геномной ДНК штамма 2-11-D931 и интегрирована в плазмиду PCUP1-GFP(URA3), гидролизованную посайтамрестрикцииBamHIandSacII.ПоследовательностьпраймеровFVTS1BamH1 и RVTS1Sac2 приведена в таблице 6.PMIT1-MIT1-GFP – центромерная плазмида, содержит гены – ampR, URA3,бактериальный и дрожжевой ориджины репликации.
Последовательность генаMIT1, включая промоторную область, была амплифицирована с помощьюпраймеров MIT1F и MIT1R (таблица 6). В качестве матрицы использоваласьплазмида YGPM21o12 геномной дрожжевой библиотеки. Амплифицированныйфрагмент был встроен в плазмиду pRS316CG, гидролизованную эндонуклеазамирестрикции ClaI и BamHI.PGPD-GAS1-YFP – мультикопийная плазмида, содержит гены – ampR, URA3,бактериальный и дрожжевой ориджины репликации. Плазмида была полученапутѐм замены последовательности PrP23-231 в плазмиде pGPD-PrP23-231-YFP(URA3)на последовательность GAS1, амплифицированную с помощью праймеров FGAS181и RGAS1 (таблица 6) и фланкированную сайтами рестрикции ВамHI и SacI.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
