Диссертация (1144700), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Белковый лизат инкубировали 10 минутс 3% саркозинатом натрия или 1% SDS при комнатной температуре.Полуденатурирующий белковый электрофорез проводили как описано ранее[Kushnirov et al., 2006] в 1,5% агарозном геле в буфере Лэмли [Laemmli, 1970],содержащем 0,1% SDS при напряжѐнности электрического поля 5 В/см, в течение3,5-4 часов. Электроперенос белков с агарозного геля на мембрану PVDF HybondP мембрану проводили с помощью модуля для переноса “Mini-PROTEAN 3 Cell”“Bio-Rad” (Италия) в буфере Лэмли, содержащем 0,1% SDS при напряженностиэлектрического поля 25V, в течение ночи.Выравнивание количества суммарного белка для полуденатурирующегоэлектрофореза проводили согласно протоколу, предложенному Брэдфордом(Bradford, 1976), и набору реактивов компании “BioRad” (США).Иммунохимическую реакцию проводили с использованием первичныхантител, представленных в таблице 8, и вторичных моноклональных антител киммуноглобулинам мыши или к иммуноглобулинам кролика, конъюгированнымис пероксидазой хрена фирмы “Amersham” (Великобритания).
Вторичные антителадетектировали с использованием наборов реактивов “ESL” и “ESL-advanced”фирмы “Amersham” (Великобритания), согласно прилагающейся инструкции.95Таблица 8. Описание антител, использованных в работеАнтителаИсточникРекомендуемоеразведениеNAB228 - моноклональныеSigma-Aldrich,мышиные антитела против AβСША11E5 - моноклональные мышиные“Invitrogen”, США1:3000Anti-GFP ИБХ - моноклональныеЛюбезно1:10000мышиные антитела против GFPпредоставлены1:5000антитела против GFPН.С. Егоровой,ИБХ, Россия6H4 - моноклональные мышиные“Prionics”,антитела против PrPШвейцария3F4 - моноклональные мышиныеSigma-Aldrich,антитела против PrPСШАAb-502604 - моноклональныеAbcam, США1:3000Chabelskaya et1:20001:60001:10000кроличьи антитела против PrPAnti-Sup35C поликлональныекроличьи антитела против домена С al., 2004белка Sup35 S.
cerevisiaeSE-45-2 - поликлональные кроличьи Kiktev et al., 20091:5000антитела против Sup45 S. cerevisiaeT6074 - моноклональные мышиныеSigma-Aldrich,антитела против Tub1США1:3000962.8.Протеомный метод выявления и идентификации амилоидовОбщая схема протеомного метода выявления и идентификации амилоидов,включающая два варианта разделения и идентификации белков приведена нарисунке 9.Рисунок 9. Схема, отражающая два варианта метода протеомного скрининга иидентификации белков, формирующих детергент-устойчивые агрегаты. А Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке 1% SDS или 3%саркозинатом натрия.
Б – разделение белков методом двумерного электофореза ии их идентификация с помощью масс-спектрометрии. В – разделение иидентификация белков методом HPLC-MALDI.972.8.1. Выделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработкеионными детергентамиВыделение фракции белковых агрегатов, устойчивых к обработке ионнымидетергентами проводили в соответствии методикой описанной ранее [Kushnorovet al., 2006], и нашими существенными модификациями [Nizhnikov et al., 2014].1. Культуру дрожжей растили сутки в 250 мл среды YPD.2. Клетки осаждали при 2500g, 10 мин., 4оС.3. Осадок (примерно 4 – 5 грамм клеток) суспендировали в 5мл буфера (50 mMTris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 10mM EDTA, 10Mm PMSF, 10mM DTT).4. Добавляли к суспензии равный объѐм стеклянных бус (0.4 mm GLC, MerckBDH) и ставили на лѐд. Клетки разрушали на дезинтеграторе “Fisher Scientific”шесть циклов по одной минуте с перерывом в одну минуту между каждымциколом для охлаждения проб на льду.5.Пробыцентрифугировалипри2500g,10мин.4oC,осадокудаляли,надосадочную фракцию переносили в другую пробирку и добавляли 5мг РНКазы.6.
Инкубировали белковый лизат в течение 30 мин. при 30°С.7. Белковый лизат наслаивали на 2мл. сахарозной подушки (25% сахароза вбуфере TBS).8. Пробы ультрацентрифугировали 2ч., 223 600g при 4oC в роторе Ti75.9. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок тщательно суспендировали в 1 млбуфера ( 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 10mM EDTA, 10Mm PMSF, 10mMDTT), доводили объѐм до 5.4 мл. и добавляли 0.6мл 10% раствора SDS (конечнаяконцентрация 1% SDS). Альтернативно, в других экспериментах вместо 1% SDS98использовали саркозинат натрия в конечной концентрации 3%. Аккуратноперемешивали, не допуская образования пены.10. Пробы наслаивали на 2 мл подушки (25% сахароза в буфере TBS).
Пробиркиустанавливали в ротор Ti75 ультацентрифуги и включали режим «отложенныйстарт». Таким образом, пробы инкубировались 4-6 часов при температуре 18оС.11. Центрифугировали пробы 8ч., 223 600g при 4oC в пробирках для ротора Ti75.12.Полученныйосадокдетергент-устойчивыхбелковыхагрегатовсуспендировали в 8мл воды и вновь центрифугировали при тех же условиях.13. Осадок высушивали в вакуумном испарителе 1 ч., 40оC (при необходимостидольше).14.
В случае разделения белков с помощью двумерного электрофореза осадокрастворяли в хаотропных агентах (смотри раздел «Двумерный разностныйэлектрофорез белков»). В случае использования методики “HPLC – MALDI”осадок растворялив 100 мкл 96%муравьиной кислоты. Если осадок нерастворялся, увеличивали объем муравьиной кислоты. Инкубировали 30 мин прикомнатной температуре.15. Осадок высушивали в вакуумном испарителе 1 ч., 40оC.16.
Осадок суспендировали в 90 мкл воды, добавляли 30 мкл буфера (100mM TrisHCL-6.8, 20% меркаптоэтанол, 10% SDS, 0.2% бромфеноловый синий, 40%глицерин) и кипятили белки 10мин при 100оС.2.8.2. Разделение и идентификация белков2.8.2.1. Двумерный разностный гель-электрофорез (2D-DIGE)Белки растворяли в регидратирующем буфере (7М мочевина, 2Мтиомочевина, 4% 3-[(3-холамидопропил) диметиламмонио]-1-пропансульфонат99(ХАМПс), 25 мМ Трис, рН 8,5) и коньюгировали с флурохромами Cy5 (опытныйобразец) или Cy3 (контрольный образец) (Luminoprobe, BioDye) в соотношении400 пмоль флуорохрома на 50 мкг белка. Концентрацию белка оценивали повеличине поглощения при длине волны 280 нм. Образцы инкубировали сфлуорохромами на льду в течение 30 мин.
в темноте. Реакцию останавливалидобавлением 10 мкмоль L-лизина с последующей инкубацией в течение 10 мин.при тех же условиях, затем белки центрифугировали 2500g, 10 мин. Растворѐнныебелки, меченные разными флуорохромами, объединяли и загружали в стрип сградиентом рН 3-10 (7 см, BioRad, США). Процесс загрузки был сопряжен спассивной регидратацией стрипа (16-18 ч. при комнатной температуре в темноте).Разделение первого направления проводили в ячейке для изоэлектрическогофокусирования (Protean IEF Cell, BioRad), следуя рекомендациям производителя(10000 Вольт-часов, финальное напряжение 4000 В, 20°C, ток не более 25мА/стрип).Перед разделением второго направления стрипы с фокусированнымиобразцами последовательно инкубировали по 15 мин.
в эквилибрирующихбуферах: первом (6 M мочевина, 2% додецил-сульфат натрия, 20% глицерин, 2%дитиотреитол, 0,375 M Трис, pH 8,8) и втором, где дитиотреитол заменен на 2,5%иодоацетамид.ЭлектрофорезвторогонаправленияпроводиливячейкеMiniProtean TetraCell (BioRad) в 15% полиакриламидном геле в трис-глициновойбуферной системе (tris/glycine/SDS buffer, BioRad) при напряжении 200 В. Длявизуализации электрофоретической картины использовали лазерный сканнер GETyphoon FLA 9500.
Наложение электрофореграмм проводили в программномобеспечении ImageJ версии 1.48v (Wayne Rasband, National Institute of Health,USA, http://imagej.nih.gov.ij). Гель окрашивали кумасси G250 (Coomassie BrilliantBlue R250, BioRad). Пятна окрашенные кумасси G250 и соответствующиесигналам, выявленным при лазерном сканирования вырезали из геля.1002.8.2.2. Идентификация белков, разделенных при помощи 2D-DIGEИдентификацию белков, вырезанных из SDS-PAGE геля, проводили припомощиматрично-ассоциированнойлазернойдисорбционно-ионнойвремяпролетной масс-спектрометрии (MALDI) на приборе Ultraflextrime (BrukerDaltonics). Кусочки геля отмывали деионизованной водой и 40% ацетонитрилом в50 мМ бикарбонате аммония.
Далее проводили дегидратацию в 100%ацетонитриле с дополнительным высушиванием на вакуумном концентраторе(Labconco). К высушенным фрагментам геля добавляли 10 мМ раствордитиотрейтола в 50 мМ бикарбонате аммония и инкубировали смесь (45 мин.,56°С). Смесь охлаждали, удаляли жидкость и добавляли раствор 55 мМйодацетамида в 50 мМ бикарбонате аммония, инкубировали 30 мин. прикомнатной температуре в темноте, далее добавляли 1 мкл раствора дитиотрейтоладляинактивациийодацетамидаивысушивалипробынавакуумномконцентраторе (Labconco). К высушенным кусочкам геля добавляли 5 мклраствора трипсина (10 нг/мкл, Sigma) и инкубировали при 37°С в течение ночи.Трипсин инактивировали добавлением 0,5 мкл 10% раствора трифторуксуснойкислоты, затем экстрагировали пептиды из геля 2%, 25% и 50% растворомйодацетамида с 50 мМ бикарбонатом аммония, проводя три последовательныеинкубации в ультразвуковой бане по 10 минут.
Далее пробы осаждали в течение30 мин. (20000 g, 4°С) и высушивали на вакуумном концентраторе (Labconco).Далее к высушенным образцам добавляли 5 мкл 0,1% раствора трифторуксуснойкислоты и наносили их на 384-луночную подложку MTP AnchorChip™ 800/384(BrukerDaltonics).Вкачествематрицыбылаиспользованаα-циано-4-гидроксикоричная кислота. При анализе пиков было использовано программноеобеспечение flexAnalysis 3.2 (Bruker Daltonics). Белки идентифицировали припомощи программного обеспечения Mascot версииhttp://www.matrixscience.com)сиспользованием2.4.2 (Matrix Science,базыданныхNCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). В качестве допустимых модификаций былиустановленыкарбоксиметилированиецистеинаичастичноеокисление101метионина. Также в качестве допустимого было указано два пропущенных сайтатрипсинолиза.Показатель«счѐтмасс-спектрометрии»,отражающийдостоверностьидентификации белка, прибор автоматически определяет по адаптированномуалгоритму «MOWSE», представленному в базе данных “Mascot database”(http://www.matrixscience.com/help/interpretation_help.html#SCORING).
Показатель«счѐт масс-спектрометрии» отражает:1.количество пептидов в последовательности идентифицированного белка,масса которых совпадает с массой пептидов, выявленных в анализе;2.точностьсовпадениямассывыявленныхпептидовстеоретическиожидаемым показателем.Счѐтмасс-спектрометриисущественноповышаетвыявлениеуникальныхпептидов, характерных только для одного белка в исследуемом протеоме.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
