Диссертация (1144700), страница 26
Текст из файла (страница 26)
Амилоидные свойства агрегатоводного из выявленных кандидатов, а именно белка клеточной стенки Gas1,подтверждены с помощью других методов (рис. 20). Метод PSIA достаточноуниверсален, поскольку позволил выявить агрегаты ранее охарактеризованныхприонов [PSI+], [PIN+] и [SWI+], амилоидные полимеры белка клеточной стенкидрожжей Bgl2, а также агрегаты белков млекопитающих PrP и Aβ.
Посколькугенетические подходы применимы лишь для выявления прионов, обладающих169фенотипическим проявлением, разработанный нами метод впервые позволяетоценить масштабность прионного феномена у исследуемых организмов.Теоретически можно было ожидать, что помимо уже охарактеризованныхприонов в дрожжевых клетках могут присутствовать прионные конформерыдругих белков, агрегация которых не вызывает видимых эффектов. Изполученных результатов по исследованию протеома различных штаммовдрожжей можно сделать вывод, что прионизация является редким событием.Выявление списка кандидатов на роль дрожжевых функциональныхамилоидов открывает широкие перспективы для дальнейших исследований.Важно отметить, что возможность применения метода PSIA не ограничиваетсяединственным объектом.
В настоящее время этот метод уже используется дляпоиска функциональных и патологических амилоидов в клетках дрожжей ибактерий, а также в мозге млекопитающих. Более того, как показали нашиколлеги из лаборатории М.Д. Тер-Аванесяна, метод PSIA перспективен и дляисследования взаимодействия прионов и амилоидов. Используя этот метод,удалось выявить шесть белков, агрегация которых индуцируется в результатесверхпродукции в клетках дрожжей мутантной последовательности белка Httчеловека. Важно отметить, что пять из этих шести белков содержат глутаминаспарагин обогащѐнные последовательности, т.е.
сходны по аминокислотнойпоследовательности с Htt и являются потенциально амилоидогенными. Этиданные представлены в нашей совместной статье [Nizhnikov et al., 2014].Поскольку амилоидогенез является автокаталитическим процессом, накоторый влияет небольшое количество дополнительных факторов, многиевопросы,возникающиеприисследованииагрегацииивзаимодействияамилоидов, могут быть решены за счѐт использования адекватных модельныхсистем.
Мы показали, что дрожжи S. cerevisiae являются удобной моделью,предоставляющей уникальные преимущества для исследования взаимодействийгетерологичных амилоидов in vivo. Белки PrP и Aβ при продукции в дрожжахформируют агрегаты, сходные по биохимическим характеристикам с агрегатами в170мозгебольныхмлекопитающих(рис.31).Используяпреимущества,предоставляемые модельным объектом, нам удалось выявить аминокислотныепоследовательности, ответственные за взаимодействие агрегатов PrP с пептидомAβ.Подводя итоги, отметим наиболее значимые результаты работы. Показано,что взаимодействие прионов вызывает наследуемые изменения признаков.Установлено, что функциональное взаимодействие прионов, может быть описановрамкахтрадиционнойклассификациигенныхвзаимодействий.Охарактеризовано новое проявление и новая функциональная активность прионов[PIN+] и [SWI+]. Разработан метод PSIA, позволяющий выявлять прионы иамилоиды в масштабах протеома.
Этот метод может быть использован длявыявления функциональных и патологических амилоидов различных организмов.Использованиеданногометодавпервыепозволилонаоснованииэкспериментальных данных составить список белков-кандидатов на рольфункциональных амилоидов в дрожжах S. cerevisiae. Показано, что использованиедрожжей в качестве модельной системы предоставляет уникальные преимуществадля анализа взаимодействий гетерологичных амилоидов in vivo.171ВЫВОДЫ:1. Взаимодействие прионов вызывает наследуемые изменения признаков:взаимодействие прионов [PIN+] и [SWI+] приводит к изменениюэффективности терминации трансляции.2. Прионизация Rnq1 и Swi1 вызывает появление новой функциональнойактивности этих белков: [PIN+] изменяет свойства прионных агрегатов[SWI+], а прионизация Swi1 вызывает супрессию нонсенс-мутации trp1289(UAG).3.
Разаботан и апробирован метод протеомного скрининга амилоидов,позволяющий выявлять и идентифицировать прионы и амилоидыразличных организмов.4. Выявлены белки, которые формируют детергент-устойчивые агрегаты вклетках дрожжей и являются кандидатами на роль функциональныхамилоидов.5. Дрожжи S. cerevisiae являются адекватной моделью, предоставляющейуникальныепреимуществадляисследованиявзаимодействиягетерологичных амилоидогенных белков - в дрожжевой модельной системевыявлены короткие последовательности прионного белка млекопитающих,определяющие специфичность взаимодействия агрегатов PrP с пептидомAβ.172СПИСОК СОКРАЩЕНИЙАТФ – аденозинтрифосфаткДа – килодальтонмкМ – микромольПК – Протеиназа-КПЦР – полимеразная цепная реакцияПЦРРВ – полимеразная цепная реакция в реальном времениСПГ – среда полная, содержащая в качестве источника углерода глицеринЦНС – центральная нервная системаЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислотаAB FRET - Acceptor photobleaching fluorescence resonance energy transferCFP – Сyan Fluorescent Protein (циановый флуоресцирующий белок)CUP1 – промотор дрожжевого гена CUP1, активируемый добавлением ионовмедиDAPI – 4,6- диамидино-2-фенилиндолDTT – dithiotreitol (дитиотреитол)EtBr – ethidium bromide (бромистый этидий)GAL1 – индуцируемый галактозой промотор гена S.
cerevisiae GAL1GFP – Green Fluorescent protein (зелѐный флуоресцирующий белок)GPD – конститутивный промотор гена S. cerevisiae GPD1GuHCl – гидрохлорид гуанидина173HPLC-MALDI (или LC-MALDI) - Жидкостная хроматография, совмещенная смасс-спектрометриейLB – среда Luria-Bertani для культивирования E.
coliMD – дрожжевая минимальная синтетическая среда с глюкозой в качествеисточника углеродаME – дрожжевая минимальная синтетическая среда с этанолом в качествеисточника углеродаMG – дрожжевая минимальная синтетическая среда с галактозой в качествеисточника углеродаPMSF – phenylmethylsulfonyl fluoride (фенилметилсульфонил флуорид)PNM –мутации, вызывающие элиминацию приона [PSI+] ([PSI+] No More)PSIA – протеомный скрининг амилоидов (Proteomic Screening for Identification ofAmyloid proteins)Poly-Q – poly-glutamine (аминокислотная последовательность, содержащаярасположенные друг за другом остатки глутамина)PrP – Prion ProteinPVDF – Polyvinylidene Difluoride membrane (поливинилиден дифтористаямембрана)ROI – region of interest (Область фотохимического разложение флуорохрома)Sc – screpi (амилоидная конформация белка PrP)SDS – Sodium Dodecyl sulfate (додецил сульфат натрия)YAPD – дрожжевая питательная среда (1% дрожжевой автолизат, 2% бактопептон, 2% глюкоза)174YFP – Yellow Fluorescent Protein (желтый флуоресцирующий белок)YPE – дрожжевая питательная среда (1% дрожжевой экстракт, 2% бакто пептон,2% этанол)2D-DIGE - Двумерный разностный гель-электрофорез175СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.
Галкин А.П., Миронова Л.Н., Журавлева Г.А., Инге-Вечтомов С.Г. Прионыдрожжей, амилоидозы млекопитающих и проблема протеомных сетей. //Генетика. – 2006. – Т. 42. № 11. – С. 1–13.2. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Фѐдорова И.В. Сборник методикпо генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука. – 1984. – 143 с.3. Инге-Вечтомов С.Г. Идентификация некоторых групп сцепления уПетергофских генетических линий дрожжей.
// Генетика. – 1971. – Т. 7. – C.113–124.4. Инге-Вечтомов С.Г. Матричный принцип как парадигма современнойгенетики // Генетика. - 2013. - Т. 49, № 1. - С. 9-15.5. Нижников А.А., А.М. Кондрашкина, А.П. Галкин. Взаимодействиедетерминанта [NSI+] с генами SUP35 и VTS1. // Генетика. - 2013. - Т.49, №10, С.
1155-1164.6. Нижников А.А., Антонец К.С., Инге-Вечтомов С.Г. Амилоиды – отпатогенеза к функции. // Биохимия. – 2015. Т. – 80. - В. 9. - , С. 1356 – 1375.7. Рогоза Т.М., Викторовская О.В., Родионова С.А., Иванов М.С., Волков К.В.,Миронова Л.Н. Поиск генов, влияющих на поддержание антисупрессорногоприоноподобногодетерминанта[ISP+]удрожжей,спомощьюинсерционной библиотеки генов. // Молекулярная Биология.
- 2009. - Т. 43.С. 392-399.8. Рубель А.А., Сайфитдинова А.Ф., Лада А.Г., Нижников А.А, Инге-ВечтомовС.Г., Галкмн А.П. Дрожжевой шаперон Hsp104 регулирует экспрессиюгенов на посттранскрипционном уровне. // Молекулярная биология. - 2008. Т.42. - №1. - С.123-130.9. Цапонина О.Е., Лада А.Г., Рубель А.А., Наволоцкая В.В, Петрова И.Т.,Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П. Аналз эффектов продукции гибридного176белка Аβ-Sup35MC в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. // Экологическаягенетика. - 2005. - Т. 3.
- Вып. 1. С. 24-33.10.Aguzzi A., Sigurdson C., Heikenwalder M. Molecular mechanisms of prionpathogenesis // Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. ¬– 2008. – Vol. 3. – P. 11–40.11.Ahmed AB, Kajava AV. Breaking the amyloidogenicity code: methods to predictamyloids from amino acid sequence. // FEBS Lett. – 2013. V. 587.
- №8. – P1089-1095.12.Alberti S., Halfmann R., King O., Kapila A., Lindquist S. A systematic surveyidentifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. //Cell. - 2009. - Vol. 137. - P. 146-158.13.Andree C., Sedivy R. Discovery of a letter from Rokitansky to Virchow aboutsubependymal corpora amylacea.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
