Диссертация (1144700), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Белок Aβ-YFP также демонстрирует высокийуровень устойчивости к обработке протеиназой К, но, в отличие от вариантов PrPCFP, не фрагментируется, а сохраняется полноразмерным (рис. 31В).На основании полученных результатов можно заключить, что исследуемыебелки (PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231-CFP и AβYFP) при продукции в дрожжах демонстрируют амилоидные характеристики.161Рисунок 31. Белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231CFP и Aβ-YFP демонстрируют амилоидные характеристики при продукции вклетках дрожжей.
А – анализ агрегации исследуемых белков методомдифференциального центрифугирования. Белковые лизаты были разделеныцентрифугированием (12,000 g) на растворимую (S – soluble) и нерастворимую (P– pellet) фракции, после электрофореза белки переносили на нитроцеллюлознуюмембрану и детектировали с использованием антител Ab-13970, специфичных кYFP (CFP). Б – Выявление детергент устойчивых полимеров исследуемых белковметодом полуденатурирующего электрофореза. Белковый лизат инкубировали 10мин при RT с 3% саркозинатом натрия, белки детектировали с использованиемантител Ab-13970. В - Анализ устойчивости исследуемых белков к обработкепротеиназой К в различных концентрациях. В качестве отрицательного контроляпоказано, что белок CFP деградирует при использовании низкой концентрациипротеиназы К.Для анализа взаимодействия агрегатов PrP с пептидом Aβ штамм BY4742был котрансформирован попарно плазмидой pGPD-Aβ-YFP(URA3) и одной из162плазмид, продуцирующих химерные белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP,PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP.
Частоты колокализации оценивали с помощьюфлуоресцентной конфокальной микроскопии. При подсчѐте частот колокализацииучитывали клетки, которые одновременно содержали агрегаты PrP-CFP, исигналы, соответствующие Aβ-YFP. Агрегаты PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP иPrP90–231-CFP колокализовались с гибридным белком Aβ-YFP с высокойчастотой (от 75 до 85% агрегатов, содержащих фрагменты PrP, имели общуюлокализацию с Aβ-YFP) (рис.
32). Частота колокализации агрегатов PrP110–231CFP с белком Aβ-YFP примерно в пять раз ниже (около 17%) (рис. 32).Рисунок 32. Анализ колокализации агрегатов белков PrP23–231-CFP, PrP28–231CFP,PrP90–231-CFPиPrP110–231-CFPсбелкомAβ-YFPметодомфлуоресцентной конфокальной микроскопии. А- фотографии клеток, копродуцирующих исследуемые белки. Б – Диаграмма, отражающая частотыколокализации исследуемых белков.
Указаны достоверные различия (p < 0,05) иошибка среднего.163Физическое взаимодействие агрегатов гибридных белков PrP-CFP с Aβ-YFPисследовали с помощью метода AB FRET (Acceptor Photobleaching FluorescenceResonance Energy Transfer). Метод AB FRET основан на том, что при облучениидонора (CFP) перенос энергии к реципиентной молекуле (YFP) происходит лишьв том случае, когда расстояние между этими молекулами составляет менее 10нм.Детекция переноса энергии методом AB FRET свидетельствует о физическомвзаимодействии исследуемых белков. Клетки, копродуцирующие PrP23–231-CFPс PrP23–231-YFP, а также PrP23–231-CFP с YFP, были использованы в качествепозитивного и негативного контроля, соответственно. Наибольший показатель ABFRET (11.5%) отмечен в клетках, используемых в качестве положительногоконтроля и копродуцирующих белки PrP23–231-CFP и PrP23–231-YFP (рис.
33).Рисунок 33. Сравнительный анализ физического взаимодействия агрегатовбелков PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP сбелком Aβ-YFP методом AB-FRET. Указаны достоверные различия (p < 0,05) иошибка среднего.164Эффективность AB FRET в клетках, ко-продуцирующих белки PrP23–231CFP и Aβ-YFP, а также PrP28–231-CFP и Aβ-YFP, составляет примерно 6%, тогдакак этот показатель в клетках содержащих белки PrP90–231-CFP и Aβ-YFP илиPrP110–231-CFP и Aβ-YFP был значительно ниже и не отличался от негативногоконтроля (рис.
33). Таким образом, фрагмент PrP28-89 необходим дляфизического взаимодействия агрегатов PrP с пептидом Aβ.В результате работы был выявлен интересный парадокс – агрегаты PrP90–231-CFP с высокой частотой колокализуются с белком Aβ-YFP (рис. 32), тогда какфизическое взаимодействие не детектируется (показатели AB FRET неотличаются от негативного контроля) (рис. 33).
Для объяснения этого парадоксамы предложили гипотезу, согласно которой агрегаты PrP90–231-CFP несвязывают мономеры Aβ, а взаимодействуют лишь с агрегатами этого пептида(смотри схему на рис. 34 и описание схемы).Поскольку колокализация отмечается в клетках, продуцирующих белкиPrP90–231-CFP и Aβ-YFP, но не PrP110–231-CFP и Aβ-YFP, следует полагать, чтокороткая последовательность PrP90-109 играет важную роль в связыванииамилоидными конформерами PrP агрегатов Aβ, но не мономеров этого пептида.Метод AB FRET позволяет детектировать перенос энергии при взаимодействииагрегатов PrP с мономерами Aβ, но при связывании предсуществующих агрегатовAβ-YFP среднее растояние между молекулами PrP и Aβ оказывается больше 10нми перенос энергии не детектируется.165Рисунок 34.
Схема, объясняющая противоречие между высокими частотамиколокализации и низкими показателями FRET при анализе взаимодействияагрегатов PrP(90-231) с пептидом Aβ. Агрегаты PrP(23-231) способны связыватькак агрегаты, так и мономеры Aβ. В случае делеции последовательности PrP(2389) агрегаты PrP(90-231) могут связывать лишь агрегаты, но не мономеры Aβ. Вэтом случае среднее расстояние между молекулами PrP(90-231) и Aβ оказываетсябольше10нм,врезультатечегопоказателиFRET неотличаютсяототрицательного контроля.На основании результатов, представленных в этом разделе, можно сделатьвывод, что дрожжи S.
cerevisiae являются удобной и адекватной моделью дляисследованияагрегацииамилоидных белков in vivo.ифизическоговзаимодействиягетерологичных166ЗАКЛЮЧЕНИЕПолученныевработеданныедополняюттеориюбелковойнаследственности. Согласно этой теории, изменение конформации белка можетподдерживатьсяавтокаталитическиивызыватьнаследуемыеизмененияпризнаков у микроорганизмов.
Иными словами, наследуемые изменения могутвозникать без каких-либо мутаций в последовательности нуклеиновых кислот.Наши результаты позволяют предложить концепцию, согласно которой не толькоприонизация одного белка, но и функциональное взаимодействие различныхприонов вызывает наследуемые изменения признаков. Более того, мы показали,что взаимодействия прионов могут быть описаны в рамках традиционнойклассификации генных взаимодействий. В отношении признака «супрессиянонсенс-мутации ade1-14 (UGA)» прионы [PIN+] и [SWI+] демонстрируюткомплементарное взаимодействие – прион [PIN+] усиливает (дополняет) действиеприона [SWI+] на исследуемыйвзаимодействияприонов,какипризнак. Согласно нашим результатам,взаимодействиягенов,необязательнопредполагают физическое связывание генных продуктов, а может бытьопосредовано дополнительными компонентами протеомных сетей.
Более того, сучѐтом наших и литературных данных об отсутствии физического связыванияразличных прионов одновременно представленных в клетках дрожжевыхштаммов, можно предсказать, что будущие исследования приведут к выявлениюне физического, а функционального взаимодействия прионов.Суммируя полученные данные можно заключить, что сквозное прочтениепреждевременного стоп-кодона ade1-14 (UGA) определяется снижением уровняпродукции белка Sup45 (рисунок 17) на фоне прионизации белков Swi1 и Rnq1.Гипотетическая схема, отражающая эффекты прионов [SWI+] и [PIN+] насупрессорный фенотип, представлена на рисунке 35. Вероятно, Swi1, являясьглобальным транскрипционным регулятором, позитивно регулирует уровеньтранскрипции гена SUP45.
Прионная инактивация Swi1 в штаммах [SWI+][pin-]вызывает слабый супрессорный фенотип (рисунок 24). [PIN+] опосредованно167(возможно, за счѐт активации фосфорилирования) усиливает инактивацию белкаSwi1 в штаммах [PIN+][SWI+], что способствует снижению уровня продукцииSup45. Уменьшение уровня продукции белка Sup45 приводит к снижениюэффективности терминации трансляции (рисунок 14) и вызывает усилениесупрессорного фенотипа.Рисунок 35.
Влияние прионов [SWI+] и [PIN+] на супрессию нонсенс-мутацииade1-14 (UGA). Красная стрелка отражает позитивный эффект белка Swi1 наэкспрессию гена SUP45. Этот эффект снижается в результате прионизации белкаSwi1 (синяя стрелка), и ещѐ менее выражен в присутствии приона [PIN+] (чѐрнаяштрихованная стрелка). «Х» - компонент (или компоненты) протеомной сети,определяющие [PIN+]-зависимую модификацию прионной формы белка Swi1.- Swi1-зависимая позитивная регуляция транскрипции гена SUP45 (числострелок отражает уровень эффективности регуляции транскрипции).168Отметим, что описанное в нашей работе взаимодействие прионов [PIN+] и[SWI+] принципиально отличается от ранее охарактеризованных белковыхвзаимодействий,вызывающихвозникновениеприона[GAR+].[GAR+]представляет собой единственный известный прион, который детерминируетсядвумя или несколькими белками [Brown and Lindquist, 2009].
Однако, важноотметить принципиальные различия между прионным фактором [GAR+] ифеноменом, описанным в нашей работе – наблюдаемая нами супрессия нонсенсмутациидетерминируетсядвумяприонами,тогдакакприон[GAR+]предположительно определяется взаимодействием белков Pma1 и Std1, [Brownand Lindquist, 2009]. В отличие от Swi1 и Rnq1, белки Pma1 и Std1не формируютнезависимых прионов.В ходе работы мы охарактеризовали не только новое проявление прионов[PIN+] и [SWI+] (их совместное влияние на нонсенс-супрессию), но и показали, чтоприонная конверсия белков Rnq1 и Swi1 приводит к появлению новойфункциональной активности этих белков. Белок Rnq1 только в прионной формевлияет на агрегацию Swi1 и усиливает эффект приона [SWI+] на супрессиюнонсенс-мутации ade1-14 (UGA). Прионизация Swi1, в свою очередь, вызываетсупрессию нонсенс-мутации trp1-289 (UAG), и эта функция не зависит отинактивации Swi1.Мы разработали и успешно апробировали метод PSIA, позволившийидентифицироватьприонныебелки,взаимодействиекоторыхопределяетизменения признака, а также выявить ряд белков, являющихся кандидатами нароль конститутивных дрожжевых амилоидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
