Диссертация (1144700), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Исходя из этого, следует, что белок Rnq1 в прионнойконформации приобретает новую функцию и опосредовано влияет на свойстваприонных агрегатов [SWI+]. Недавно было показано, что Rnq1 только в прионнойизоформе вызывает гиперфосфорилирование белка Pin4 [Yang et al., 2014].152Вполне вероятно, что прионные агрегаты Rnq1 секвестрируют репрессор киназы,которая ответственна за гиперфосфорилирование не только Pin4, но и некоторыхдругих белков, и в частности Swi1.
В связи с этим, интересно отметить, что убелка Swi1 выявлено необычно много (двенадцать) потенциальных сайтовфосфорилирования (http://www.yeastgenome.org).Полученные данные позволяют сформулировать концепцию, согласнокоторой функциональные взаимодействия прионов, опосредованные другимикомпонентами протеомной сети, могут вызывать наследуемые измененияпризнаков.
По аналогии с признаками, наследование которых контролируетсяодним или несколькими генами, можно утверждать, что существуют признаки,проявлениекоторыхконтролируетсяприонизациейодногобелка,иливзаимодействием различных прионов.Несмотря на то, что взаимодействия прионов можно описать в рамкахтрадиционной классификации взаимодействий генов, мы не можем согласиться савторами, которые предлагают рассматривать прионы в качестве генов или«белковых генов» [Chernoff , 2001; Wickner et al., 2004]. Ген представляет собойединицу наследственного материала, кодирующую одну макромолекулу.
Прион,несомненно, является матрицей, кодирующей наследственную информацию оконформации белка [Инге-Вечтомов, 2013], но он не кодирует молекулу белка, алишь изменяет еѐ конформацию и функциональную активность. Как былопоказано ранее, прионизация приводит к тем же последствиям, что и мутации[Chernoff, 2001]. Разница заключается в том, что мутация приводит к изменениюсамого гена, а прионизация вызывает наследуемое изменение генного продукта.На основании приведѐнных рассуждений мы приходим к заключению, что прионне является геном, поскольку не кодирет макромолекулу, а вызывает изменениееѐ свойств.Когда мы говорим о взаимодействии генов, то на самом деле речь идѐт овзаимодействии генных продуктов (в нашем случае белков). Исходя из этого,153становится понятным, почему взаимодействие прионов приводит к таким жепоследствиям, как взаимодействие классических генов.
Мы показали, что прионы[SWI+] и [PIN+] демонстрируют комплементарное взаимодействие по отношениюк признаку «супрессия нонсенс-мутации ade1-14(UGA)». Теоретически можнопредсказать, что прионы могут взаимодействовать также по типу эпистаза иразличных вариантов полимерии.1543.4.Оценка универсальности метода PSIA – выявление амилоидныхагрегатов белков млекопитающих в клетках дрожжейНаш метод протеомного скрининга был успешно использован дляидентификацииглутамин-аспарагинобогащѐнныхдрожжевыхбелков,формирующих прионные агрегаты.
Мы предположили, что данный метод можетслужить универсальным инструментом для выявления различных амилоидов улюбых организмов. Для проверки этой гипотезы мы оценили возможностьвыявления агрегатов PrP и Aβ млекопитающих с помощью метода PSIA припродукции этих белков в дрожжах S. cerevisiae. Ранее было показано, что белкиPrP и Aβ агрегируют в дрожжах, и агрегаты PrP, подобно полимерам PrPSc в мозгемлекопитающих, демонстрируют высокий уровень устойчивости к обработкепротеиназой К [Ma and Lindquist, 1999].Штамм BY4742 [PIN+] трансформировали плазмидами PGPD-PrP90-231GFP(URA3) и PGPD-Aβ-GFP(URA3), продуцирующими гибридные белки PrP(90231)-GFP и Aβ40-GFP под контролем промотора GPD.
Поскольку прион [PIN+]уверенно идентифицируется методом PSIA (см. раздел «Разработка и апробацияметода «протеомного скрининга амилоидов»), сигнал, соответствующий белкуRnq1, может служить положительным контролем. В качестве отрицательногоконтроля использовали [pin-] дериват штамма BY4742, трансформированныйплазмидой pRS316CG, продуцирующей белок GFP под контролем промотораCUP1. Фракции, содержащие белковые агрегаты, устойчивые к обработке 1% SDSи 3% саркозинатом натрия, были выделены и очищены из опытных иконтрольных образцов как описано в разделе «Материалы и методы».
Дляудобствадемонстрацииполученныхрезультатов,былаиспользованамодификация метода PSIA, включающая двумерный электрофорез белков,окрашенных флуорохромами. Белки из «опытных» образцов, содержащих белкиAβ-GFP или PrP(90-231)-GFP, окрашивали флуорохромом Cy5 (красный), а белкииз контрольного образца зелѐным флуорохромом Cy3. Белки Aβ-GFP и PrP(90231)-GFP были выявлены во фракции белковых агрегатов, устойчивых к155обработке 3% саркозинатом натрия (рис. 28; таблица 20), но не обнаружены приобработке белковых лизатов 1% SDS (не представлено).Рисунок 28. Изображения двумерных гель-электрофорезов белков, выделенныхметодомPSIAизштаммаBY4742,трансформированногоплазмидами,продуцирующими белки Aβ-GFP (А) и PrP(90-231)-GFP (Б) и из его деривата[pin-].
Белки, выделенные из штамма BY4742 [PIN+] и его деривата [pin-], метилифлуорохромами Cy5 и Cy3, соответственно.Эти результаты соответствуют ранее полученным данным, согласнокоторым амилоидные конформеры пептидаAβ устойчивы к обработкесаркозинатом, но растворимы в SDS [Coalier et al., 2013]. На основаниипредставленных результатов можно заключить, что разработанный методдостаточно универсален и может быть использован для идентификацииразличных белков, формирующих амилоидные полимеры.156Таблица20.Идентификацияметодоммасс-спектрометриибелков,формирующих агрегаты устойчивые к обработке саркоазинатом натрия, вштаммах BY4742 / PGPD-Aβ-GFP(URA3) и BY4742 / pGPD-PrP(90–231)-GFPШтаммБелокСчѐтBY4742 / pU-Ab-GFPAb-GFP137Rnq1215PrP(90–231)-GFP310Rnq194BY4742 / pGPD-PrP(90–231)-GFPНезависимо от нас был разработан сходный подход для идентификацииприонов и амилоидов [Kryndushkin et al., 2013].
Так же как и мы, авторыобрабатывали белковый лизат додецилсульфатом натрия при комнатнойтемпературе, но затем не отделяли детергент устойчивые агрегаты от прочихамилоидов ультрацентрифугированием, а разделяли белковую смесь в агарозномгеле. На заключительном этапе белковые полимеры выделяли из геля иидентифицировали при помощи HPLC-MALDI [Kryndushkin et al., 2013]. Данныйподход, как и разработанный нами метод, позволил выявлять SDS-устойчивыеагрегаты дрожжевых прионов [PSI+] и [PIN+], однако прионные агрегаты Sup35 иRnq1 выявлялись не во всех исследованных штаммах [PSI+] и [PIN+].
Метод,описанный в этой статье, также не позволяет выявлять SDS-чувствительныеамилоиды, подобные тем, которые образуют химерные белки Aβ-YFP и PrP-CFP.Мы считаем, что наш метод значительно превосходит описанный аналог по рядупараметров.1573.5.Оценка амилоидных характеристик и анализ взаимодействия in vivoамилоидных агрегатов белка PrP с пептидом Aβ в дрожжах S. cerevisiaeКак было отмечено в разделе «Обзор литературы», белок PrP и пептид Aβвзаимодействуют друг с другом лишь в том случае, когда один из партнѐровпредставлен в амилоидной конформации [Morales et al., 2010]. Взаимодействиеолигомеров Aβ с мономерами PrPC, по всей видимости, способствует гибелинейронов в случае болезни Альцгеймера [Lauren et al., 2009; Kudo et al., 2013].Это взаимодействие хорошо изучено и выявлены короткие последовательностиPrP23–30аа и PrP95–110аа, ответственные за связывание патологическихолигомеров Aβ с мономерами PrP [Lauren et al., 2009; Chen et al., 2010].Поскольку взаимодействие PrP с Aβ зависит от конформационных измененийэтих белков, следует ожидать, что за физическое взаимодействие агрегатов PrPSc сAβ отвечают иные последовательности.
Мы исследовали взаимодействиеагрегатов PrP с пептидом Aβ в дрожжевой модельной системе.Для анализа агрегации амилоидогенных белков млекопитающих в дрожжахштамм BY4742 трансформировали плазмидой pGPD-Aβ-YFP(URA3), содержащейгибридный ген Aβ-YFP, а также плазмидами pGPD-PrP23-231-CFP(LEU2), pGPDPrP28-231-CFP(LEU2)pGPD-PrP90-231-CFP(LEU2)иpGPD-PrP110-231-CFP(LEU2),содержащими различные фрагменты PrP, слитые с последовательностью,кодирующей CFP. С помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии мыпоказали, что Aβ-YFP образует цитологически детектируемые агрегаты вдрожжевых клетках (рис.
29). Все гибридные белки, содержащие полноразмерныйPrP (PrP23-231-CFP) и его различные делетированные производные (PrP28–231CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP), также агрегировали в дрожжах (рис.29).158Рисунок 29. Агрегация гибридных белков Aβ-YFP, PrP23-231-CFP, PrP28–231CFP, PrP90–231-CFP и PrP110–231-CFP в клетках штамма BY4742. Всеисследуемые белки образуют цитологически детектируемые агрегаты в клеткахдрожжей.Вкачествеотрицательногоконтроляиспользовалиплазмиду,продуцирующую белок CFP, который равномерно распределѐн в цитоплазме.Мы показали, что агрегаты PrP23–231-GFP и Aβ-GFP локализованы вцитоплазме дрожжевых клеток и не колокализуются с ядром, вакуолями,эндосомами и липидными включениями (рис. 30).
Ранее были опубликованыданные, согласно которым Aβ–GFP колокализуется с липидными включениями вклетках дрожжей [Caine et al., 2007]. В этой работе авторы использовали159флуоресцентный краситель «Нильский красный». Мы использовали краситель«Судан чѐрный», поскольку, как мы показали, флуоресценция «Нильскогокрасного» детектируется как при использовании фильтра RFP, так и GFP, даже вклетках, которые не содержат химерный белок Aβ–GFP. Таким образом, можнозаключить, что Aβ-GFP не колокализуется с липидными включениями в клеткахдрожжей, по крайней мере в штамме BY4742.Рисунок 30.
Сравнительный анализ локализации агрегатов PrP23–231-GFP и AβGFP с различными клеточными компартментами и липидными включениями.Вакуолярная мембрана (красный цвет) окрашена красителем FM4–64, эндосома(синий) красителем Liso-tracker Blue, ядро и митохондрии (синий цвет) выявлялиза счѐт использованияДНК-специфичного красителя DAPI. Липидныевключения окрашивали красителем Судан чѐрный (чѐрный цвет).Методом дифференциального центрифугирования и иммуноблотинга сиспользованием антител, распознающих последовательности GFP, YFP и CFP, мыподтвердили, что белки PrP23–231-CFP, PrP28–231-CFP, PrP90–231-CFP, PrP110–231-CFP и Aβ-YFP формируют в дрожжевой клетке высокомолекулярные160нерастворимые агрегаты, которые детектируются в основном в осадочнойфракции “Pellet”, тогда как белок CFP выявляется исключительно в растворимойфракции (рис.
31А).Для оценки амилоидных свойств исследуемых белков мы охарактеризовалиустойчивость агрегатов к обработке ионными детергентами и протеиназой К. Спомощью метода полуденатурирующего электрофореза с использованием антителAb502604, специфичных к PrP, мы показали, что все исследуемые белкиформируют агрегаты, устойчивые к 3% саркозинату натрия (рис. 31Б), но не к 1%SDS (результат не представлен). Более того, после обработки гибридных белковPrP-CFP протеиназой К, в концентрации 50 µg/ml интактным остаѐтся фрагментразмером 19-20 KDa (рис. 31В). Такой же фрагмент, размером 19-20 KDa,соответствующий последовательности PrP(90-231), был выявлен раньше припродукции белка PrP(23-231) в мозге больных млекопитающих и в клетках S.cerevisiae [Ma and Lindquist, 1999].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
