Диссертация (1144700), страница 23
Текст из файла (страница 23)
На основании этих данных можно заключить,что штаммы [NSI+] содержат белки Rnq1 и Swi1 в принной изоформе [PIN+] и[SWI+], соответственно. Анализ агрегации белка Mit1-GFP был проведѐн как спомощью метода дифференциального центрифугирования, так и методомполуденатурирующего электрофореза. Результаты, представленные на рисунке21Г, свидетельствуют о том, что белок Mit1-GFP агрегирует как в штамме [NSI+],так и [nsi-]. Отметим, что в эксперименте была использована центромернаяплазмида PMIT1-MIT1-GFP и можно полагать, что агрегация химерного белка Mit1GFPотражаетуровеньагрегациинативногобелкаСMit1.помощьюполуденатурирующего электрофореза мы показали, что лишь небольшая долябелка Mit1-GFP оказывается устойчива к обработке SDS (рисунок 22В).
По всейвероятности, уровень агрегации белка Mit1 в штаммах [NSI+] и [nsi-] неразличается. Сам по себе факт агрегации Mit1 интересен, поскольку этот белокявляетсяключевымтранскрипционнымфактором,регулирующимпсевдогифальный рост дрожжей (Cain et al, 2012). Возможно, при выращиванииштаммов на полной среде именно агрегация Mit1 приводит к его инактивации иингибированию псевдогифального роста. Вместе с тем, полученные результатысвидетельствуют, что белок Mit1 не является детерминантом [NSI+].142Рисунок 21. Сравнительный анализ агрегации белков Rnq1-CFP, Swi1-YFP иMit1-GFP в штаммах [NSI+] и [nsi-].
А – Белок Rnq1-CFP формирует SDSустойчивые полимеры в штамме [NSI+], но не в штамме [nsi-]. Б - в штамме [NSI+]белок Swi1-YFP представлен в осадочной фракции («О» - осадочная фракция),содержащей высокомолекулярные белковые агрегаты, а в штамме [nsi-]представлен в надосадочной растворимой фракции («Н» - надосадочная фракция).В – лишь небольшая доля белка Mit1-GFP выявляется во фракции SDSустойчивых полимеров. Г – Методом дифференциального центрифугированияустановлено, что белок Mit1-GFP представлен в осадочной фракции как в штамме[NSI+], так и [nsi-].На основании полученных данных можно предположить, что признаки,наблюдаемые в штаммах [NSI+], опосредованы прионами [PIN+] и (или) [SWI+].143Для проверки возможного влияния приона [PIN+] на проявление фактора [NSI+]был получен штамм 7-1-1-D931 с делецией гена RNQ1. Делеция гена RNQ1вызвала резкое снижение уровня нонсенс-супрессии (рис.
22). Рост на среде безаденина детектируется лишь на пятыйданногоштаммаплазмидой,день. Последующая трансформациясодержащейгенRNQ1,неприводитквосстановлению темпов роста на среде без аденина. Таким образом, как делециягена RNQ1, так и потеря фактора [PIN+], приводят к резкому ослаблениюсупрессорного фенотипа. Слабый супрессорный фенотип стабильно наследуется иэлиминируется при пассировании на среде с GuHCl (рис.
22). Делеция гена RNQ1,как и потеря фактора [PIN+], не оказывает влияния на рост дрожжей на средах снеферментатируемыми источниками углерода (не представлено). На основанииполученных результатов можно заключить, что проявление фактора [NSI+]определяется как минимум двумя компонентами - прионом [PIN+] и ещѐ однимприоном, который элиминируется GuHCl.Рисунок 22. Влияние приона [PIN+] на проявление фактора [NSI+]. Анализ ростана среде без аденина до и после пассирования на среде с GuHCl штаммов: 4-1-1D931 [NSI+]; 7-1-1-D931 (дериват штамма [NSI+], с делецией гена RNQ1); 7-1-1D931, трансформированный плазмидой pID130, содержащей ген RNQ1 подконтролем собственного промотора.144Наиболее вероятным кандидатом на роль второго детерминанта фактора[NSI+] является белок Swi1.
Данные, представленные в разделе 3.1. «Выявление ихарактеристика прионного фактора [NSI+]» предполагают, что детерминантфактора [NSI+], как и Swi1, имеет ядерную локализацию и регулируеттранскрипцию других генов. Более того, мутации в гене SWI1, как и фактор[NSI+], вызывают нарушения споруляции и дефекты роста на средах снеферментируемыми источниками углерода [Nasmyth, 1987; Lohr et al., 1995].Для проверки влияния приона [SWI+] на поддержание и проявление фактора[NSI+] необходимо делетировать ген SWI1, а затем вновь ввести этот ген висследуемый штамм. Такой подход приводит к элиминации исследуемого прионаи позволяет оценить его возможные эффекты. Мы получили дериват штамма 4-11-D931 [NSI+], с делецией гена SWI1.
Делеция гена SWI1 в штамме 7-4-1-1-D931приводит к усилению супрессорного фенотипа и вызывает задержку роста насредах с галактозой и глицерином (рис. 23).опосредованныеделециейгенаSWI1,неФенотипические изменения,элиминируютсяврезультатепассирования клеток на среде с GuHCl (не представлено).
Последующее введениеплазмиды p426GPD–SWI1YFP вызывает полную элиминацию всех проявленийфактора [NSI+] – трансформанты, так же как клетки штамма [nsi-] не растут насредах без аденина и триптофана и не демонстрируют дефектов роста на средах сгалактозой (рис. 23). Таким образом, временная инактивация гена SWI1 вызываетэлиминацию всех проявлений прионного фактора [NSI+]. Вместе с тем,супрессорный фенотип, характерный для штаммов [NSI+], наблюдается лишь приналичии двух прионов [SWI+] и [PIN+] (см.
рисунки 22 и 23).145Рисунок 23. Влияние приона [SWI+] на проявление фактора [NSI+]. Делеция генаSWI1 и последующая трансформация исследуемого штамма плазмидой p426GPDSWI1YFP приводят к элиминации всех проявлений фактора [NSI+].На основании полученных данных можно заключить, что наблюдаемыенаследуемые изменения признаков определяются не неизвестным прионнымфактором [NSI+], а зависят от взаимодействия двух прионов [SWI+] и [PIN+].
Мывпервые показали, что взаимодействие прионов, подобно взаимодействиюклассических генов, вызывает наследуемые изменения признаков.1463.3.Анализ взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+]Для исследования взаимодействия прионов [SWI+] и [PIN+] мы решилиоценить вклад каждого приона в регуляцию супрессорного фенотипа.
Штаммы[swi-][PIN+] и [SWI+][pin-] были получены из исходного штамма [SWI+][PIN+] засчѐт делеции хромосомных копий генов SWI1 и RNQ1, соответственно, ипоследующей трансформации штаммов плазмидами, кодирующими данные гены.Напомним, что временная потеря гена-детерминанта вызывает элиминациюсоответствующего приона [Wickner et al., 1999]. Был проведѐн сравнительныйанализ проявления нонсенс-мутаций ade1-14 (UGA) и trp1-289 (UAG) в клеткахштаммов [SWI+][PIN+], [swi-][PIN+], [SWI+][pin-], [swi-][pin-] а также swi1Δ[PIN+].Полученные результаты представлены на рисунке 24.В случае анализа супрессии trp1-289 (UAG) какого-либо взаимодействияприонов отмечено не было – рост на среде без триптофана зависит исключительноот приона [SWI+] (рисунок 24).
Интересно отметить, что в случае прионизацииSwi1 уровень супрессии trp1-289 (UAG) заметно выше, чем в штамме с делециейгена SWI1 (рисунок 24).При анализа роста исследуемых штаммов на среде без аденина отмечаетсявзаимодействие прионных детерминантов. Слабая супрессия проявления нонсенсмутации ade1-14 (UGA) отмечается в штамме [pin-] [SWI+] (рисунок 24). Сильныйсупрессорный фенотип характерен для штамма [SWI+][PIN+].
Делеция гена SWI1вызывает ещѐ большее усиление супресии мутации ade1-14, чем наличие вштамме прионов [SWI+] и [PIN+]. С точки зрения формальной генетическойлогики прослеживается следующая схема:1.Прионная инактивация белка Swi1 в штаммах [SWI+][pin-] вызывает слабуюсупрессию проявления нонсенс-мутации ade1-14 (UGA);2.На фоне прионизации белка Rnq1 в штаммах [SWI+][PIN+] инактивация Swi1усиливается, что закономерно приводит к усилению супрессорногофенотипа;1473.
Отсутствие белка Swi1 в штаммах swi1Δ приводит к ещѐ большейсупресии проявления исследуемой нонсенс-мутации.Описаннаясхемаполностьюсоответствуетклассическомутипукомплементарных взаимодействий – один наследственный детерминантдополняет влияние другого на проявление признака. Есть только одно отличие– в нашем случае имеет место не взаимодействие классических генов, авзаимодействие прионов.
Такой феномен описан впервые. Как мы показалиранее, снижение эффективности терминации трансляциив исследуемыхштаммах определяется прион-зависимым подавлением уровня экспрессии генаSUP45 (рисунок 17). Очевидно, тонкий эффект приона [PIN+] на терминациютрансляции, который детектируется при анализе роста на среде без аденина, неимеет фенотипического проявления при анализе супрессии нонсенс-мутацииtrp1-289 (UAG).Рисунок 24. Анализ влияния взаимодействий прионов [SWI+] и [PIN+] насупресиию проявления нонсенс-мутаций ade1-14 (UGA) и trp1-289 (UAG).148Для проверки гипотезы о влиянии приона [PIN+] на прионные агрегатыбелка Swi1 был проведѐн сравнительный анализ агрегации белка Swi1-YFP вштаммах 1-1-D931 [SWI+][PIN+]), 6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin-], 7-1-4-1-1-D931 [swi][PIN+] и 1-4-1-1 [swi-][ [pin-] (рис.
25 и таблица 19). Наибольший процент клеток сагрегатами Swi1-YFP отмечен в штамме 6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin-] (примерно8%). Примерно такой же процент клеток с агрегатами Swi1-YFP характерен дляштаммов [SWI+], описанных ранее [Crow et al., 2011].Рисунок 25. Агрегация белка Swi1-YFP в штаммах 4-1-1-D931 [SWI+][PIN+]; 6-14-1-1-D931 [SWI+][pin-], 7-1-4-1-1-D931 [swi-][PIN+] и 1-4-1-1-D931[swi-][ [pin-]149Таблица 19. Результаты сравнения частот агрегации химерного белка Swi1-YFP вштаммах 4-1-1-D931 [SWI+][PIN+]; 6-1-4-1-1-D931 [SWI+][pin-], 7-1-4-1-1-D931[swi-][PIN+] и 1-4-1-1-D931[swi-][ [pin-]Штамм4-1-1-D931[SWI+][PIN+]7-1-4-1-1-D931[swi-][PIN+]6-1-4-1-1-D931[SWI+][pin-]1-4-1-1-D931[swi-][ [pin-]№трансформантаОбщееколичествоклетокКоличествоклеток сагрегатамиПроцентклеток сагрегатами12027663,2622226783,532175984,5421951205,452219652,931139780,582146470,483146430,24135980,595149280,54118971497,85218131608,82318671789,53419441115,7518901105,8211836201,0921709211,233182160,3341969150,7651787261,45Среднеезначениепроцентаклеток сагрегатами3,50,547,851,09Этот результат, как и данные делеционного анализа и дифференциальногоцентрифугирования, подтверждает наше заключение о наличии приона [SWI+] висследуемых штаммах.
Важно отметить, что в штамме 4-1-1-D931 [SWI+][PIN+],который в отличие от штамма 6-1-4-1-1-D931 содержит прион [PIN+], процентклеток с агрегатами Swi1-YFP примерно в два раза ниже (3,5%). С помощью150критерия Манна-Уитни мы показали, что наблюдаемые различия статистическизначимы (p=0,01). Исходя из полученных результатов, можно заключить, чтоприсутствие приона [PIN+] влияет на прионные агрегаты [SWI+]. Наличие редкихагрегатов Swi1-YFP в штаммах 7-1-4-1-1-D931 [swi-][PIN+] и 1-4-1-1-D931 [swi][pin-] связано с тем, что данный белок на фоне сверхпродукции спонтанноагрегирует в небольшой доле клеток в штаммах [swi-] [Cow et al., 2011]. Различияв уровне нонсенс-супрессии и в частотах агрегации белка Swi1-YFP, которыедемонстрируют штаммы [PIN+][SWI+] и [pin-][SWI+], свидетельствуют о том, чтоприон [PIN+] прямо или опосредованно влияет на прионные агрегаты белка Swi1.Полученные результаты показывают также, что прионизация Rnq1 и Swi1приводит к появлению новой функциональной активности этих белков.Прионизация белка Rnq1 влияет на агрегацию Swi1 и усиливает эффект прионныхагрегатов [SWI+] на супрессию проявления нонсенс-мутации ade1-14 (UGA).Прионизация Swi1 вызывает супрессию проявления нонсенс-мутации trp1-289(UAG), тогда как инактивация этого белка в результате делеции гена SWI1 такогоэффекта не вызывает.Для проверки гипотезы, согласно которой имеет место физическоевзаимодействиеприонов[PIN+]и[SWI+],штаммD955[PIN+][SWI+]трансформировали плазмидами pCUP1-RNQ1-CFP(LEU2) и p426GPD–SWI1YFP,кодирующими гибридные белки Swi1-YFP и Rnq1-CFP.
Клетки, в которыходновременно присутствовали сигналы, соответствующие белкам Rnq1-CFP иSwi1-YFP, выявлялись с очень низкой частотой. Известно, что сверхпродукцияRnq1 токсична и, по всей вероятности, одновременная сверхпродукция Rnq1-CFPи Swi1-YFP усиливает токсический эффект. Ни в одной из нескольких тысячпроанализированных клеток колокализации агрегатов Rnq1-CFP и Swi1-YFPотмечено не было(рисунок 27).Ранее в работе других исследователей также было показано, что прионныеагрегаты белков Swi1 и Rnq1 физически не взаимодействуют в штаммах151[PIN+][SWI+] [Du and Li, 2014]. Из наших и литературных данных следует, что[PIN+] оказывает не прямое, а опосредованное влияние на прионные агрегатыбелка Swi1.Рисунок27.АгрегатыхимерныхбелковRnq1-CFPиSwi1-YFPнеколокализуются в клетках штамма [PIN+][SWI+].Как мы показали (см.
рис. 14), супрессия, наблюдаемая в штаммах[SWI+][PIN+](ранееобозначенныхкак[NSI+]),приводиткснижениюэффективности терминации трансляции. Снижение эффективности терминациитрансляции опосредовано уменьшением уровня экспрессии гена SUP45 (рисунок17). Поскольку белок Swi1 является транскрипционным регулятором более чем6% дрожжевых генов [Peterson and Herskowitz, 1992; Burns and Peterson, 1997],эффект его прионной инактивации на уровень экспрессии гена SUP45 итерминацию трансляции вполне объясним, однако остаѐтся загадкой, какимобразом на этот процесс влияет прион [PIN+]. Наши и литературные данныесвидетельствуют о том, что прионные агрегаты белков Swi1 и Rnq1 физически невзаимодействуют.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
