Диссертация (1141409), страница 8
Текст из файла (страница 8)
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1.Краткоеописаниеобъектовисследования,особенностейихзаготовки и консервации.Объектомисследования служили плоды и листья яблони лесной,заготовленные от дикорастущих растений в подлеске смешанного леса вИстринском и Чеховском районах Московской области в августе-сентябре2015-2017 г., а также образцы любезно предоставленные Ботаническим садомПетра Великого им. В. Л. Комарова и ботаническим садом МГУ им.Ломоносова, для ряда сравнительных анализов использовались листья иплоды яблони домашней позднеспелых сортов Антоновка и РенетСимиренко, широко культивируемых на территории РФ, соответствующиетребованиям ГОСТ 21122-75 «Яблоки свежие поздних сроков созревания».Отобранные образцы использовались для исследований в свежем,замороженном и высушенном виде.
Заготовленное сырье немедленнопередовалось на сушку, которую проводили, используя шкафы лабораторныесушильные при соблюдении режима сушки в контролируемом интервале 5070 С.Для части собранных образцов листьев, плодов яблони леснойприменяли консервацию замораживанием, которую проводили согласнонормативамГОСТ РФ 53956-2010 «Фрукты быстрозамороженные» ,осуществляя интенсивное снижение температуры исследуемого сырьясформированием центров образования льда до достижения внутри массызамораживаемых образцов температурного значения - 18 С с соблюдениемсредней скорости снижения температуры не ниже 0,5 см/ч ( скоростьзамораживания образцов сырья – отношение толщины замороженного слояобрабатываемого сырья, см, ко времени ч, в течение которого замороженныйслой полностью сформировался ).Образцы высушенного сырья листьев и плодов яблони лесной исортовые образцы яблони домашней поздних сроков созревания хранились в51мешках промышленного изготовления из бумаги с учетом требованийнормативной документации [ОФС 1.1.0011.15 «Хранение лекарственногорастительного сырья и лекарственных растительных препаратов» ГФ ХIII] вспециальном помещении с уровнем контроля влажности, температуры,обеспечением возможности проветривания, исключая попадания прямыхсолнечных лучей.
Хранение замороженных образцов осуществляли вморозильныхкамерахвпакетахполиэтиленовых.Свежеесырьеиспользовалось для непосредственного анализа, проводимого не позднее 24часов со времени заготовки.Отбор точечных, объединенных, средних и аналитических проб листьеви плодов яблони лесной производили согласно рекомендациям общей статьиГФ ХIII (ОФС.1.1.0005.15 Отбор проб лекарственного растительного сырья илекарственных растительных препаратов).В процессе выполнения экспериментальной работы использовалисьнастои, настойки гомеопатические матричные, образцы жидкого экстракта исиропаизисследуемогорекомендациямисырья,полученныевсоответствиисГФ ХI, ХIII, XIV.В процессе экспериментальных исследований нами использовалисьреактивыиреагенты,соответствующиетребованиямнормативно-технической документации, регулирующей их доброкачественность.Припроведенииэкспериментальныхисследований,требующихиспользования стандартных образцов, использовались представленные нароссийском рынке стандартные образцы различных производителей («SigmaAldrich» и «Flucka» и др).522.2.
Краткая характеристика аналитических методов и лабораторногооборудования, используемых при изучении исследуемого сырья2.2.1. Анализ арбутина в листьях, плодах яблони леснойИдентификациюиспользованиемарбутинавкачественныхисследуемыхобъектахреакций79][76,ипроводилиметодомсТСХ.Пробоподготовку для проведения качественных реакций проводили согласнорекомендациям ГФ ХI, для осуществления хроматографического анализа 0,5г сырья, предварительно измельченного на лабораторной мельнице (точнаянавеска) помещали в смесь, полученную смешиванием равных объемовметанола и воды дистиллированной общим объемом 5 мл и осуществлялинагрев с использованием холодильника обратного на водяной бане не менее15 минут.
Полученное горячее извлечение сразу же фильтровали, споследующим промыванием фильтра смесью из равных объемов метанола иводы. Анализ извлечения проводили на хроматографических пластинках«Merk» в системах растворителей:*кислота муравьиная безводная – вода-этилацетат (6:6:88)В качестве стандартов использовали арбутин, галловую кислоту игидрохинон, которые в количестве 25 мг растворяли в метаноле и доводилиобъем полученного раствора сравнения до 10,0 мл этим же растворителем.Пробы наносили на пластинки в количестве 20 мкл для исследуемогоизвлечения и 10 мкл для раствора сравнения, содержащего стандартныеобразцы. После прохождения фронта растворителей пластинки высушивалипритемпературе105-110ºСиопрыскивалирастворомдихлорхинонхлоримида в метаноле (концентрация 10г/л), с последующейобработкой раствором натрия карбоната.Также с целью идентификации арбутина использовали сравнение УФспектров извлечений из анализируемых образцов листьев, плодов яблонилесной с УФ- спектром, полученным для СО арбутина при используемой53длине волны 280 нм, а также метод высокоэффективной жидкостнойхроматографии.
Нами применялась металлическая колонка Kromasil C18 спараметрами 4,6 х 250 мм. Размер частиц неподвижной фазы составлял 5микрон. В качестве подвижной фазы нами использовалась системарастворителей состава: СН3ОН - Н2О - Н3РО4 (концентрированная),приготовленная в соотношении объемов компонентов 400: 600: 5.Элюированиеосуществлялосьвизократическомрежиме.Анализисследуемых образцов проводили после стандартной пробоподготовки прикомнатной температуре. Контроль скорости подачи элюента осуществлялсяна уровне 0,8 мл/ мин.
Время эксперимента составило 70-80 минут.Детектирование проводилось с использованием УФ-детектора «GILSTON»UV/VIS модели 151. Использовалась аналитическая длина волны 280 нм.Примерно 10,00 г. (точная навеска) исследуемых образцов листьевяблони лесной, предварительно измельченных, количественно помещали вколбу вместимостью 0, 250 л, заливали сырье 70 мл С2Н5ОН (70%), затемколбу подсоединяли к обратному холодильнику и проводили нагревание накипящей водяной бане в течение 1 часа с начала кипения экстракционнойсмеси. По завершении времени экстракции, исследуемое извлечениефильтровали, используя лабораторный фильтр мембранный (диаметром порфильтра 0,25-0,45 мкм) в колбу мерную вместимостью 100 мл (первые 5- 7мл фильтрата отбрасывали), после чего доводили объем полученногоизвлечения этанолом 70% до метки.Параллельно осуществляли приготовление 0,05% растворов веществфенольной природы СО в 70% этаноле по известной методике.
[92, 179] По20 мкл исследуемых растворов и раствора сравнения вводили в хроматографс использованием микрошприца Hamilton емкостью 25 мкл и осуществлялихроматографирование.Количественное содержание арбутина в анализируемых образцах сырьяяблони проводили с применением иодиметрического титрования по54известнойфармакопейнойметодике.Процесспробоподготовкианализируемого высушенного сырья яблони лесной включал проведениеизмельчения аналитической пробы до размера частиц, проходящих черезсито с диаметром отверстий 2 мм.
Листья яблони лесной, при консервациикоторых использовалось замораживание, а также сырье, постыпавшее наисследование свежим нарезали до достижения размера частиц, проходящихчерез сито с диаметром отверстий 7-9 мм.2.2.2. Изучение состава и оценка суммарного содержания флавоноидовИдентификацию флавоноидов проводили методом ТСХ в системахрастворителей хлороформ – метиловый спирт (8:2) и этилацетат –метановаякислота безводная –вода (70:15:15) с детектированием зон, соответствующихвеществам флавоноидной природы в УФ –свете при длине волны 365 нм ипоследующей обработке спиртовым раствором алюминия хлорида 5%.
Послеобработки детектирующим реагентом пластинку нагревали при температуре100-105ºС в сушильном шкафу в течение 2-3 мин, после чего просматривалипри дневном освещении.Идентификациюкомпонентногосоставафракциифлавоноидовпроводили так же методом ВЭЖХ на приборе «GILSTON» UV/VIS МОДЕЛЬ151».Для проведения эксперимента высушенные плоды и листья яблонилесной подвергали измельчению до достижения размера частиц сырья,способных проходить через сито, диаметр отверстий которого составляет 3мм (ГОСТ 214-83). Около 1,0 г исследуемого сырья (точная навеска)аккуратно переносили в колбу вместимостью 100 мл, приливали 20 млС2Н5ОН 70%, колбу с анализируемым сырьем и экстрагентом присоединялик обратному холодильнику и осуществляли извлечение на кипящей водянойбане в течение 60-70 минут с начала закипания водноспиртовой смеси вэкстракционной колбе.
По завершении времени экстракции, исследуемую55смесь подвергали последовательно охлаждению и фильтрации в мернуюколбу объемом 25 мл, с применением фильтра бумажного лабораторного.Объем полученного извлечения доводили С2Н5ОН 70% до метки.Параллельно осуществлялось приготовление серии 0,05% растворовсравнения стандартных образцов в 70% спирте этиловом.
При проведениихроматографического анализа исследуемые извлечения и растворы сравненияобъемом 20 мкл вводили в хроматограф и проводили исследование повышеизложенной методике.Количественноеопределениесуммарногосодержаниявеществфлавоноидной природы проводили спектрофотометрическим методом впересчете на 3-рутинозид кверцитина по приводимой далее методике.Стадияпробоподготовкиизмельчениеаналитическойисследуемогопробыдосырьядостиженияпредусматриваларазмерачастиц,проходящих сквозь сито, с диаметром отверстий 2 мм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
