Диссертация (1141409), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Извлечения фильтровали, остаток вновь заливали 50 мл водыдистиллированной и данную стадию повторяли дважды. Водные извлечения,полученные трехкратной экстракцией, объединяли и использовали дляопределения групповой принадлежности БАВ.83Сполученнымиизвлечениямиизсвежих,высушенныхиконсервированных замораживанием плодов и листьев яблони проводиликачественные реакции на группы БАВ с использованием наиболее широкораспространенныхвфармакопейноманализереактивов.Результатыпредварительного фитохимического анализа новых видов сырья листьев,плодов яблони лесной свежих, высушеных и замороженных, представлены втаблице 14. Как видно из данных таблицы для всех изучаемых видов сырьяпредварительно подтвержденоналичие таких групп БАВ, как дубильныевещества, флавоноиды, полисахариды, сапонины.84Таблица 11.
БАВ, обнаруженные в результате предварительного химического анализа листьев, плодов яблони леснойБАВКачественные реакцииОжидаемый результатОбнаружено при анализеЛистьевСвежихПлодовВысушенЗаморожСвежиВысушЗамороныхенныххенныхженныхДубильныевещества1.Реакция осажденияраствором желатина: к 2-3мл извлечения из сырьяприливали по каплямОбразование видимого++++++помутнения, исчезающего вслучае внесения избыточногоколичества желатина.свежеприготовленныйраствор желатина.Образование черно-2. К 2-3 мл извлеченияфиолетового окрашивания сприбавляли 4-5 капельпостепенным развитиемраствора квасцов++++++++++++зеленовато-черного цветажелезоаммониевых.3. К 2 мл извлеченияприливали по каплям 1%раствор антипирина.Образование осадка светлосерого цвета.854. К 2 мл извлеченияПостепенное формированиеприливали по каплямжелтоватого творожистогосвежеприготовленнуюосадка.++++++++++++бромную воду.5.
К 2 мл извлеченияприбавляли 3-4Образование темно-кристаллика натрия нитрата коричневого окрашиванияи 3 капли 0,1 М растворакислотыхлористоводороднойФлавоноиды 1.Цианидиновая проба: К 3мл извлечения приливают 5капель концентрированнойкислотыхлористоводородной и до10 г цинка.
Реакционнуюсмесь прогревают накипящей водяной бане втечение 3 минут.2.Образование розоватооранжевого окрашивания++++++86ПолисахариК 10 мл водного извлеченияОбразование хлопьевидныхдыприливали 30 мл спиртасгустков, образующих осадокэтилового 95%при стоянии5 мл водного извлеченияОбразование обильной исильно встряхивают встойкой во времени пеныСапониныпробирке++++++++++++874.2.Идентификацияиколичественнаяоценкафлавоноидовифенолкарбоновых кислот листьев, плодов яблони леснойАнализ литературных данных показал, что плоды яблони лесной содержатширокий спектр фенолкарбоновых кислот, характеризующийся достаточновысоким содержанием [173, 179]. При этом указанные вещества способнывстречаться в растительном сырье как в свободном, так и связанном виде – всоставе гликозидированных производных и сложных эфиров.Учитывая вышеизложенное для идентификации фенолкарбоновых кислот вплодах и листьях яблони лесной, пробоподготовка исследуемого сырьяосуществлялась с проведением предварительного щелочного гидролиза, длярасщепления связанных форм кислот.Извлечения из плодов и листьев яблони лесной получали по следующейсхеме.Методика.
Аналитическую пробу свежих и замороженных плодов и листьевяблони измельчали до кашицеобразного состояния, а высушенных листьев иплодов – до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2мм. 50 г свежих или замороженных измельченных плодов или листьев, или 10 гвысушенных (точная навеска) помещали в колбу, снабженную шлифом емкостью300 мл, приливали 150 мл спирта этилового 70% и нагревали с обратнымхолодильником на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Полученноеизвлечение из сырья охлаждали и фильтровали через пятислойный марлевыйфильтр в колбу емкостью 500 мл. К фильтрату приливали 150 мл 1 М растворанатрия гидроксида и оставляли при комнатной температуре в течение суток, дляосуществления щелочного гидролиза. Затем содержимое колбы количественнопереносили в делительную воронку емкостью 500 мл, приливали 150 млэтилацетата и встряхивали в течение 20 мин. По окончании расслаиванияэтилацетатный слой желтоватой окраски собирали в колбу емкостью 300 мл.Обработкуфильтратаэтилацетатомосуществлялидважды.Полученное88этилацетатное извлечение упаривали под вакуумом на ротационном испарителедо объема 15 мл.На стартовую линию хроматографической пластинкимикрошприцемнаносили по 20 мкл полученных этилацетатных извлечений из исследуемогосырья и осуществляли хроматографирование восходящим способом в системерастворителей толуол – метиловый спирт – кислота уксусная ледяная (90 : 16 : 4),показавшей лучшее разделение компонентов фракции фенолкарбоновых кислот впредыдущих исследованиях плодов семейства Rosaceae.
[5, 6]После прохождения фронтом растворителей 10-12 см, хроматографическуюпластинку извлекали из камеры, просушивали на воздухе в течение 5-7 мин. иобрабатывали раствором железа хлорида с последующим нагреванием всушильном шкафу при 105ºС в течение 5 минут.На хроматограммах извлечений из свежих и замороженных образцовнаблюдалось 7 зон адсорбции. Со стандартными образцами идентифицированыгалловая кислота (Rf около 0,37), кофейная кислота (Rf около 0,33).Анализ качественного состава флавоноидов и фенолкарбоновых кислот вплодах и листьях яблони лесной проводили методом ТСХ проводили так же всистеме растворителей н-бутанол – уксусная кислота – вода (40: 12 : 28 ).Хроматограммы просматривали и УФ-свете. На хроматограмме извлечений излистьев яблони лесной были обнаружены 9 зон с значением Rf 0,34; 0,36 ; 0,47 ;0,51; 0,57; 0,61; 0,68 ; на хроматограмме извлечений из плодов яблони леснойвыявлены 7 зон.
Общий вид хроматограммы приведен на рисунке 18.89Рисунок.18 Схема хроматограммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислотизвлечений из листьев, плодов яблони лесной1- Извлечение из плодов яблони лесной высушенных;2- Извлечение из листьев яблони лесной высушенных;3- РСО кислота галловая4- РСО кислоты кофейная5- РСО рутин6- РСО катехин7- РСО кверцитин8- РСО лютеолинТаблица 12. Результаты исследования флавоноидов и фенолкарбоновых кислотизвлечений из листьев и плодов яблони лесной, а также НМГ и сухих экстрактовиз исследуемого сырья методом ТСХ в системе н-бутанол: уксусная кислота:вода (40:12:28)ИсследуемыйобразецRf пятенИдентифицированоНеидентифицировано90Извлечение изплодов яблонилесной0,340,370,450,490.570.610.68Кофейная;Галловая;Катехин;рутинВещество с Rf=0,37Вещество с Rf= 0,68Вещество с Rf=0,61Извлечение излистьев яблонилесной0,340,360,450,490.570.620.650.700,780,340,370,450,490.570.610.680,340,360,450,490.570.620.650.700,790,340,370,450,490.570.610.680,340,360,450,490.570.620.650.700,790,49Кофейная кислота;Галловая кислота;Катехин;Рутин;Кверцитин;лютеолинВещество с Rf=0,36Вещество с Rf=0,62Кофейная;Галловая;Катехин;рутинВещество с Rf=0,37Вещество с Rf= 0,68Вещество с Rf=0,61Кофейная кислота;Галловая кислота;Катехин;Рутин;Кверцитин;лютеолинВещество с Rf=0,36Вещество с Rf=0,62Кофейная;Галловая;Катехин;рутинВещество с Rf=0,37Вещество с Rf= 0,68Вещество с Rf=0,61Кофейная кислота;Галловая кислота;Катехин;Рутин;Кверцитин;лютеолинВещество с Rf=0,36Вещество с Rf=0,62__НМГ плодовяблони леснойНМГ листьевяблони леснойСухой экстрактплодов яблонилеснойСухой экстрактлистьев яблонилеснойГСО рутина(ФС 42-2508-87)91СО катехина(№CAS 154-23-4)СО галловойкислоты(№ CAS 59-95-868)РСО кофейнойкислотыСО кверцетин( № CAS 6151-253)0,63__0,33__0,45__0,65__0,70__СО лютеолина(№ CAS 491-70-3)Отличий в количестве зон на хроматограммах свежих, высушенных изамороженных плодов и листьев яблони лесной идентифицировано не было.Валидациюметодикиосуществлялипоспецифичностивыбраннойхроматографической системы.
Определение специфичности методики анализакачественного состава флавоноидов и фенолкарбоновых кислот осуществляли посовпадению между собой основных зон адсорбций, по их соответствиюпредложенной методике в образцах извлечений из исследуемых листьев, плодовяблони лесной.Приемлемость оценивалась по совпадению зон адсорбций, исследуемыхобразцов сырья –листья, плоды яблони лесной описанию предложеннойметодики.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
