Диссертация (1141409), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Проведенные контрольные эксперименты подтвердили совпадениямежду собой зон адсорбции исследуемых образцов, а также их соответствиепредложенной намми методике.Суммарное содержание флавоноидов в пересчете на рутин (2-(3,4дигидроксифенил)- 5,7- дигидро-кси-3-[α-L-рамнопиранозил- ( 16 ) -β-Dглюкопиранозилокси]- 4Н-хромен-4-он) рассчитывали спектрофотометрическимметодом по известной методике.Спектрофотометрическое исследование осуществляли на приборе SPECORD250Analitik Jena AG (производство Германии) в кварцевых кюветах в диапазоне92длин волн 240-500 нм.
Статистическую обработку полученных результатовосуществляли в соответствии с требованиями методик, продставленных в ГФХIII. Валидация осуществлялась по критериям линейности, повторяемости,воспроизводимостииправильностиметодики.Пробоподготовкалистьевосуществлялась по стандартной методике, широко применяемой при анализелекарственного растительного сырья, для свежих и замороженных плодов яблонилесной применялось истирание в ступке с стеклянным порошком.В качестве стандартного образца применяли ГСО Рутин (ФС 42-2508-87).УФ-спектр ГСО рутина в спирте этиловом представлен на рисунке.20Рис.19. УФ-спектр исследуемого образцаРис.20. УФ –спектр ГСО Рутин93Содержания флавоноидов в листьях и плодахяблони лесной32,521,510,50Листья (р-нЧеховский)Плоды (р-нЧеховский)СвежиеЛистья (р-нИстринский)ЗамороженныеПлоды (р-нИстринский)ВысушенныеРис.21.
Содержание флавоноидов в листьях и плодах яблони леснойУчитываямногочисленныелитературныеданные,подтверждающиенепосредственную связь между содержанием в сырье яблони лесной флавоноидовифармакологическойактивностью, а такжепланируявключить методколичественной оценки суммарного содержания флавоноидов в разрабатываемуюнормативную документацию на листья, плоды яблони лесной, осуществиливалидацию предлагаемой методики. Линейность методики проверяли на пятиотобранныхэкспериментальныхточках(значенияхконцентрации).Анализируемые растворы получали увеличением аликвотной доли, составившей0,75; 1,0; 2,0; 2,5; 3,0 мл соответственно. На графике представлена зависимостьвеличины оптической плотности от взятых аликвот на анализ и от содержанияфлавоноидов в сырье соответственно.
Как видно, из данных графика, значениекоэффициента корреляции, который представляет собой критерий приемлемостилинейности, составил 0,9867, т.е. демонстрирует значение близкое к 1, что в своюочередь, подтверждает наличие линейной зависимости между значениемвеличины оптической плотности исследуемых образцов и действующих веществ.Таблица13.Результатыподтверждениялинейностиметодикиспектрофотометрического определения суммарного содержания флавоноидов.94Номер образцаАликвотная доля, млОптическая плотность, А10,750,117821,000, 207332,000,393842,500,497553,000,6015Рис.22 Результат проверки линейности методики спектрофотометрическогоопределения суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутинА0,7y = 0,1258x - 0,01370,6R² = 0,98670,50,40,30,20,100,751,002,002,503,00Аликвотная доля, млТаблица14.Результатыоценкивоспроизводимостиметодикиспектрофотометрического определения суммарного содержания флавоноидовПовторностьСодержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин влистьях яблони леснойОбразец 1Образец 2Образец 312.5132.4762,53722.4992.4892,54932.5182,4782.534Хср2.5102.4812.540RSD, %0,320.630.4595ТаблицаРезультаты15.оценкиповторяемостиметодикиспектрофотометрического определения суммарного содержания флавоноидовНомер образца123456Содержание флавоноидов,2,4992,5102,4462,5242,4842,546%ƒср2S∆X∆срt (99%)ɛ, %RSD,%52,5010.001190.03450.0390.0182.031.560.96Таблица 16.
Результаты определения правильности методики.НомерСуммарноеДобавленоОжидаемоеПолученноеобразцасодержаниеСО рутина,содержание,гсодержание,гфлавоноидов вгОткрываемость,%пробе, г10,02500,010,0350,032693,1420,02500,020,0450,0467103,7730,02500,030,0550,053998,0040,02480,010,03480,033696,5550,02480,020,04480,0451100,6660,02480,030,05480,0554101,0970,02560,010,03560,034897,7580,02560,020,04560,0459100,6590,02560,030,05560,0562101,07RSD, % = 2,183При выявлении повторяемости нами проводилось шесть параллельныхизмерений, после чего рассчитывалась величина стандартного отклонения иотносительногостандартногоотклонения.Относительноестандартноеотклонение составило 0,96% (не более 10%), что подтверждает прецизионностьпредлагаемойметодикивусловияхповторяемостиэксперимента.96Воспоизводимость методики проверяли два аналитика на трех исследуемыхобразцах в трех повторностях.Правильность методики оценивали методом добавок путем добавления СОрутина в точно известном количестве к исследуемым экспериментальнымобразцам с использованием девяти определений при трех значениях содержанияфлавоноидов в исследуемом образце.
Как следует из данных таблицыотносительное стандартное отклонение не превышает 5%, что подтверждаетотсутствие систематической ошибки.Предварительный качественный анализ гидроксикоричных кислот проводилис использованием бумажной хроматографии на хроматографической бумагемарки «Filtrak» FN 2 в системе растворителей н-бутанол – кислота уксусная –вода (4:1:2) После высушивания хроматограмму просматривали в видимом иультрафиолетовом свете.
Доминирующие зоны адсорбции соответствоваликофейной и хлорогеновой кислотам, демонстрирующим в ультрафиолетовомсвете голубую флуоресценцию. После обработки хроматограмм с исследуемымиобразцами извлечений из плодов и листьев яблони раствором 1% железа хлорида(III) в метаноле зона кофейной кислоты приобретает серо-зеленую, ахлорогеновой –зеленую окраску.Идентификацию гидроксикоричных кислот и флавоноидов в плодах илистьяхяблонилеснойосуществлялитакжеметодомВЭЖХ.Хроматографический анализ этанольного извлечения из листьев и плодов яблонилесной, заготовленных в различные фазы вегетации, показал идентичностьбиологически активных веществ, состав которых представлен в таблице 20 и нарисунке 23.ор и чн а я к- т а 0 .02 80 .0.0 02400п0 и.0г1е 8н и н 0 .
0 0 9н 1 0 .3 0 5КннАнн 0 .0 0 3нФ 0л.2о р5 и9н 0 .2 8 5 д з и н 0 . 3 6 4ch1456789101112131415161718192021222324минн 0 .0 0 00К в е р ц е т и н 0 .3 0 2Ф л о р е т и н 0 .1 2 650н 0 .6 0 8н 0 .8 1 6100Э Г К Г 0.1 31150К у м а р и н 0 .1 2 2200Р у т и н 1 .2 6 2250Х л о р о ге но в а я к т 0 .4 6 0В иц е н ин 0.8 09Н е о х л о р о г е н о в а я 0 .2 1 2300К а т е х ин 2 .41 9Э п ик а т е хи н 2 .90 6К о ф е й н а я к - т а 0 .1 2 0н 0 .0 7 2Г а л л о в а я к- т а 0.0 89Ц и ко ри е в а я к- т а 2 .89 9mV97Рис.23 – Хроматограмма спиртового извлечения из листьев яблони леснойметодом ВЭЖХ при 280 нм (70% спирт этиловый)Таблица 17. Результаты исследования фенольных соединений в сухом и свежемсырье – листья яблони лесной, методом ВЭЖХ.№Время,ПлощадьПлощадьНазваниемин14.46486.710.12Кофейная к-та24.94552.110.07Неидентифицирован35.31764.340.09Галловая к-та45.6242088.282.90Цикориевая к-та57.1611741.892.42Катехин67.6952093.012.91Эпикатехин78.507331.600.46Хлорогеновая к-та89.063582.900.81Виценин99.594152.450.21Неохлорогеновая к-та1010.22908.781.26Рутин1111.8487.840.12Кумарин1212.5694.000.13ЭГКГ1314.4438.150.61Неидентифицирован1414.86588.030.82Неидентифицирован1517.9217.320.30Кверцетин1618.1490.670.13Флоретин1721.1186.740.26Неидентифицирован98262.500.36Флоридзин1921.32205.580.29Неидентифицирован2021.952.270.00Неидентифицирован2122.637422.0610.31Неидентифициров2223.6519.940.03Коричная к-та2323.8614.280.02Неидентифицирован2424.072.960.00Неидентифицирован2524.496.540.01Апигенин2624.5812.900.02Неидентифицирован2727.670.000.00Неидентифицирован2828.7425.730.04Неидентифицирован2937.4954243.5275.31Неидентифицирован0Кн о0р.4и 1ч 8н а я к - т а 0 .
1 6 0И з оф е р у л ов а я кт 0.3 76н 0 .7 4 6н 0 .2 5 5Ф е р у л о в а я к -т а 0 .1 8 920н 0 .0 7 340н 0 .4 4 260Э п ик а т е хи н 4 .18 6И з о х л о р о ге н о в а я 2 .4 5 5Х л о р о ге но в а я к т 2 .9 9 6н 4 .4 7 480н 5 .2 5 2mVн 1 2 .1 3 321.22нн 00.3.41634К о ф е й н а я к - т а 0 .3 6 6н 0 .0 4 2Г а л л о в а я к- т а 4.3 6718ch134567891011121314151617181920212223минРис.24 – Хроматограмма спиртового извлечения из плодов яблони леснойметодом ВЭЖХ при 280 нм (70% спирт этиловый)Таблица 18. Результаты определения состава фенольных соединений в сухом исвежем сырье – плоды яблони лесной, методом ВЭЖХ.№Время,ПлощадьПлощадьНазваниемин14.18782.450.46Неидентифициров24.36755.710.31Неидентифициров9934.65365.090.37Кофейная к-та45.0017.520.04Неидентифициров55.395776.264.37Галловая к-та66.634933.635.25Неидентифициров77.2422578.0314.50Катехин87.761744.154.19Эпикатехин98.148436.422.46Изохлорогеновая108.605532.553.00Хлорогеновая кт119.17795.284.47Неидентифициров129.7583777.2421.25Неидентифициров1310.8878.620.44Неохлорогеновая1412.1313.060.07Рутин1513.7645.310.25Неидентифициров1614.2533.590.19Феруловая к-та1720.23132.620.75Флоретин1821.612156.7312.13Флоридзин1922.7366.910.38Изоферуловая кт2023.5428.500.16Коричная к-та2123.6274.360.42Неидентифициров2232.491.570.01Неидентифициров2332.66.230.04Неи дентифициров2433.548.960.05Кемпферол2534.174.880.03Неидентифициров2634.223.160.02Неидентифициров2734.296.900.04Неидентифициров2836.042260.3012.72Неидентифициров2936.082037.0211.46Неидентифициров3037.6213.280.07Неидентифициров3144.8114.910.08Неидентифициров3246.710.580.00Неидентифициров3346.894.440.02Неидентифициров100Рис.25.
Схема содержания веществ фенольной природы в литьях, плодах яблонилесной.Таблица 19. Результаты количественного определения гидроксикоричных кислотв листьях яблони в пересчете на кислоту кофейную в период цветения№Исследуемый объектобразцаСодержаниегидроксикоричных кислот впересчете на кислотукофейную, %1Листья яблони лесной, заготовленные в1,881±0,96Истринском районе московской области2Листья яблони лесной, заготовленные в2,340±0,74Чеховском районе московской области3Листья яблони домашней сорта Антоновка1,794±0,924Листья яблони домашней сорта Ренет1,657±0,72СемиренкоСтатистическая обработка данных шести параллельных измерений показала,что количественное содержание гидроксикоричных кислот в листьях яблонилесной в пересчете на кислоту кофейную составило от 1,9644 до 2,7480 в периодплодоншения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
