Диссертация (1141409), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Совпадение спектров исследуемых извлечений соспектром стандарта достоверно указывает на идентичность соединений, что былоиспользовано для идентификации арбутина, выделенного из листьев груши [39].Для идентификации арбутина многими авторами использовались химическиепревращения (гидролиз, ацетилирование, метилирование и др.) с последующимсравнением констант продуктов превращения с литературными данными. Так,арбутин состава С12Н16О7, выделенный из листьев груши, имеющий температуруплавления152-153С,ацетилировалисобразованиемпентаацетильногопроизводного состава С22Н26О12, с температурой плавления 146 С.
[57]Как уже упоминалось выше, согласно требованиям ГФ количественнаяоценкасодержанияарбутинавсырьеосуществляетсяиодометрическимтитрованием гидрохинона, получаемого после извлечения и гидролиза арбутина.При титровании продукта гидролиза арбутина раствором йода определениеточка эквивалентности осуществляется визуально по изменению окраскииндикатора, что зависит от субъективных факторов и может приводить к ошибке.Так же следует отметить длительность процесса количественного определенияарбутинасиспользованиемфармакопейногометода,чтоприводиткнеобходимости использования физико-химических методов анализа.
[114, 189].Известенфотоэлектроколориметрическийметодколичественного[17]определения, основанный на осуществлении реакция образования азокрасителяпослевзаимодействия(сульфацил-натрий).Приарбутинаанализесдиазотированнымлистьевисульфаниламидомкорневищбадана[121]119количественное содержание арбутина осуществляли по калибровочному графику.Минимальным значением, при котором осуществляется идентификация арбутинаустановлена концентрация 6,3 мкг/мл. При этом автор отмечает, что используемаяпри пробоподготовке извлечения очистка экстракта бадана от балластныхсоединений полифенольной природы осаждением их раствором Рв(СН3СОО)2влечет потери арбутина, что может существенно повлиять на результатыколичественного анализа, проводимого фотоколориметрическим методом [23,121].
Многие авторы используют в исследованиях различные вариацииспектрофотометрического метода определения арбутина, среди которых наиболееиспользуемыми оказались:метод, основанный на измерении оптическойплотности в видимой области спектра после получения антипиринового красителя[121] и метод, осуществляемый при аналитической длине волны 281 нм послефильтрования исследуемого извлечения через слой алюминия оксида сприменением полученного значения удельного показателя поглощения арбутина,составившего 77,3 ±3,1 [52].В американской [238] и европейской [192] растительных фармакопеяхколичественную оценку содержания арбутина в сырье осуществляют методомВЭЖХ. Согласно требованиям европейской фармакопеи [192], исследуемое сырьеподвергают двукратной экстракции водой очищенной, в качестве неподвижнойфазыприменяютизократическомамериканскойоктадецилсиликагель,режиме,методикеподвижная[238]фазаэлюирование–предусмотреноосуществляютвода-метанолиспользование(90:10).ввПокачественеподвижной фазы также октадецилсиликагеля, используется градиентный режимэлюирования смесями метанола и воды очищенной.
Детектирование проводят придлине волны 280 нм. Так же согласно литературным данным, для анализаарбутина методом ВЭЖХ наиболее используемыми являются обращенная фазаС18 в качестве сорбента и элюент, имеющий кислый рН среды [1]. При этомиспользование элюентов с рН менее 2,0 не рекомендуется, т.к. снижаетстабильность неподвижной фазы за счет возможного гидролиза силанольных120групп сорбента [1].
Так, с целью совершенствования метода количественногоопределения арбутина в листьях толокнянки была разработана методикаобращенно-фазовой ВЭЖХ [52]: детектирование при 280 нм , подвижная фаза:0,01 М КН2РО4 ,подкисленный Н3РО4 до рН=3 и ацетонитрил (9:1) с расходомподвижной фазы 0,6 мл/мин., а для анализа сырья и спиртовых извлечений изсвежих и высушенных побегов рододендрона [92] использовалась подвижная фазаСН3ОН – Н2О- Н3РО4(концентрированная) всоотношении компонентовподвижной фазы по объему 80 : 120 : 1 в условиях изократического элюирования,осуществляяподачу элюента со скоростью 0,8 мл/мин. Проводя оценкуколичественного содержания арбутина, содержащегося в сырье различных видовбадана (Bergenia crassifolia, B.
Cordifolia, B. Ligulata, B. Ciliate), собранных вразличных климатических зонах, в разные фазы вегетации, также использоваласьВЭЖХ. [135,162].Учитывая имеющиеся литературные данные, характеризующие присутствиев различном сырье рода Malus арбутина, мы сочли целесообразным провестианализ изучаемого сырья на содержание в нем арбутина. В исследованиииспользовалиськачественныереакциинаарбутин,рекомендуемыефармакопейными методиками, а также реакции образования антипириновогокрасителя и азокрасителя, описанные в литературе [52], ТСХ и УФспектрофотометрия.ПрипроведенииТСХ-анализаприменялихроматографические пластины «Сорбфил ПТСХ – АФ-А-УФ».
Детектированиеосуществляли,просматриваядиазобензолсульфокислотывхроматограммыпосленасыщенномраствореобработкинатриярастворомкарбоната.Регистрацию спектров осуществляли на спектрофотометре SPECORD 250 дляспиртовых извлечений из исследуемого сырья.С учетом результатов, полученных в наших предыдущих исследованиях [42]при анализе извлечений из листьев яблони лесной, рекомендуемые дляподтверждения арбутина в сырье качественные реакции проводились нами до и121после осаждения полифенольных веществ с применением основного ацетатасвинца. Результаты представлены в приложении № 5.По окончании проведения хроматографического разделения, пластинкивысушивали и просматривали в УФ-свете, наблюдая развитие интенсивнойфлюоресценции пятен фиолетового цвета.
Затем пластинки обрабатывалиреактивом Паули и наблюдали появление окрашенных, совпадающих зонадсорбции извлечений из сырья и арбутина-стандарта с значением величины Rf=0,87 +0,01.Спектрофотометрическим метододом для идентификации арбутина былиполучены спектры исследуемых извлечений из листьев яблони лесной и яблонидомашнейразныхсортов,ирастворастандартногообразцаарбутина,совпадающие по конфигурации кривой и положению минимумов и максимумов,что позволяет идентифицировать арбутин во всех исследуемых образцах.Для идентификации арбутина в исследуемом сырье нами так жеиспользовался метод ТСХ, включенный в Фармакопею республики Беларусь.
Всистеме растворителей кислота муравьиная безводная – вода – этилацетат(6:6:88). После проявления хроматограммы раствором дихлорхинонхлоримида вметаноле на участке, соответствующем испытуемому раствору обнаруживается 8зон, среди которых три совпадают с зонами и окраской стандартов гидрохинона(ГОСТ 19627-74 Гидрохинон (парадиоксибензол)) (зона синего цвета), галловойкислоты (CAS 5995-86-8 Biochem) (зона коричневого цвета) и арбутина (зонасинего цвета).
Наиболее интенсивная зона арбутина была характерна для свежихи замороженных листьев яблони лесной, высушенное сырье - плоды яблонилесной содержат арбутин в следовых минорных значениях.Выбордлиныволныдляпроведениядальнейшихисследованийосуществлялся путем анализа УФ-спектров стандартного образца арбутина вспирте этиловом и спиртового извлечения из исследуемого сырья- листья яблонилесной.122Таблица 30. Выбор оптимальной длины волны для исследования листьев яблонилесной разных способов консервацииРис.33. УФ-спектрспиртового извлеченияРис.32. УФ-спектрарбутина-стандартаИдентификацию арбутина в исследуемых образцах осуществляли методомВЭЖХ по описанной в разделе «Материалы и методы» методике.Полученные нами результаты выявили в спиртовых извлечениях из листьевяблони лесной с использованием метода внутренней нормализации соединений,всоставекоторыхобнаруженарбутин13((2R,3S,4S,5R,6S)-2-гидроксиметил-6-(4-гидроксифенокси) оксан-3,4,5-триол).
Следует отметить, чтохроматограмма спиртовых извлечений из сухих и свежих листьев яблони леснойидентичны. (рис.34, таблица 34.)100ch12468н 6.68 620н 0.99 430н 0.60 7н 3.63 4н 2.19 8н 0.46 740н 4.75 650К в е р ц е т и н - 3 - гл к 1 5 .9 9 0К ве р ц е т и н -3-р ун 1 1 .5 6 5И з о р а м н е т и н -3 -60н 5.88 0А р б у т и н 6 .4 1 8mV12310 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48минРис.34 – Хроматограмма спиртового извлечения из листьев яблони леснойметодом ВЭЖХ, при 370 нмТаблица 31. Результаты анализа фенольных соединений в исследуемом сырье –яблони лесной листья разных способов консервации, методом ВЭЖХ.124Содержание арбутина в пересчете на абсолютно сухое сырье определялиметодом абсолютной калибровки с применением компьютерной программыМультихром Windows. Расчет осуществляли по формуле:С (%) =ис.
×Сст. ×100×100×100ст. ×25××(100−); гдеис. – площадь пика в исследуемом растворе;ст. – площадь пика раствора арбутина СО;С (%) – содержание арбутина, %;Сст. – масса навески арбутина СО;α– масса сырья, взятого на анализ, г;W – потеря в массе при высушивании в %;Метрологические характеристики методики количественного определенияарбутина в спиртовых извлечениях из листьев яблони лесной в пяти независимыхповторностях представлены в таблице 32.Таблица 32.
Результаты определения метрологических характеристик методикиколичественной оценки содержания арбутина в спиртовых извлечениях изисследуемого сырья - яблони лесной листья.125Относительная ошибка используемой методики количественной оценкисодержания арбутина с 95%-ой вероятностью составляет ±0,908% для свежих и ±0,890% для высушенных листьев яблони лесной.Как отмечалось выше, результаты иодометрического титрования образцовизвлечений исследуемого сырья составили около 3%, что несколько выше, чемзначения показателей количественного содержания арбутина в исследуемомсырье, определяемых по методике ВЭЖХ.Увеличенный выход арбутина в методике йодометрического титрования можетбыть объяснен наличием незначительных количеств примесных веществ полифенольной природы, что, соответственно, сказывается на возрастании расчетныхпоказателей при проведении титрования.Содержание арбутина в листьях и плодах яблонилесной4,543,532,521,510,50Листья (р-нЧеховский)Плоды (р-нЧеховский)СвежиеЛистья (р-нИстринский)ЗамороженныеПлоды (р-нИстринский)ВысушенныеРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
