Диссертация (1141409), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Около 1, 0 г (точнаянавеска)сырьяяблонилесной,предварительноподвергшихсяпробоподготовке, помещали в коническую колбу, снабженную шлифомвместимостью 0, 25 л, вносили 100 мл С2Н5ОН 70%. Колбу с исследуемойсмесью аккуратно подсоединяли к обратному холодильнику и осуществлялинагревнаводянойбаневтечениеполуторачасов,осуществляяпериодическое встряхивание с целью смывания частиц сырья со стенокэкстракционной колбы.
По истечении времени экстракции колбу сспиртовымизвлечениемохлаждалидотемпературылаборатории.Извлечение подвергали фильтрации через фильтр из бумаги фильтровальнойобщелабораторного назначения, промытый предварительно этанолом 70%.Первые10-15млфильтратаотбрасывали.Данноеизвлечениеиспользовалось для проведения реакции комплексообразования с алюминияхлоридом, для чего из него аналитической пипеткой осуществляли забор 2.0мл исследуемого извлечения и переносили в мерную колбу вместимостью 25мл, приливали 5 мл раствора алюминия хлорида 5% в этиловом спирте 70% и56по истечении 10 минут вносили 1 мл этановой кислоты 3%. Полученнуюсмесь доводили до метки этанолом 70% и оставляли на 0,5 часа длястабилизации образующегося комплекса. По истечении получаса измерялиоптическую плотность анализируемого извлечения с использованием кювет столщиной слоя 10 мм.
Используемая длина волны в эксперименте составила410 нм.Оценку суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутин дляабсолютно сухого сырья рассчитывали с учетом удельного показателяпоглощения, рассчитанного для продукта реакции комплексообразованиярутина с алюминия хлоридом:Х= × 100 × 25 × 1000 × × 2 × (100 − )Где А - значение показателя оптической плотности исптуемого извлечения;А – значение удельного показателя поглощения комплекса рутина салюминия хлоридом при длине волны 4109 нм, значение которогопринимается за 260;а- навеска сырья, взятого для анализа, гр.;W – Влажность сырья, %2.2.3.Изучениесоставаиоценкасуммарногосодержаниягидроксикоричных кислотВсе использованные в исследовании реактивы имели степень чистотыч.д.а.
Изучение качественного состава биологически активных веществосуществляли в извлечениях из листьев яблони, полученных экстракцией70% этиловым спиртом, на высокоэффективном жидкостном хроматографефирмы «GILSON»,производства Франции, модель 305 , снабженном ручныминжектором , моделипоследующейRHEODYNE 7125 USA с использованиемкомпьютернойобработкойполученныхданных57экспериментального анализа с применением программы Мультихром дляWindows. В эксперименте применялась колонку металлическая размером 4,6х 250 мм KROMASIL С18, размер частиц неподвижной фазы составил 5 мкм.Вкачествеэлюетаприменялисмесь–CH3-CNH2O–H3PO4(концентрированная) в соотношении 20: 80: 0,05.
Анализ осуществляли притемпературе лаборатории. Подвижную фазу подавали со скоростью 1,0мл/мин. Время проведения анализа варьировало от 40 до 60 минут.Детектирование осуществляли с применением УФ-детектора «GILSON» UV/VIS модель 151 при аналитической длине волны, равной) 370 нм [83].Оценку количественного содержания гидроксикоричных кислот в сырьеяблони лесной осуществляли методом спектрофотометрии в пересчете на(НО)2С6Н3СН=СНСООН (кофейная кислота; 3,4-диоксикоричная кислота;3-(3,4-дигидрофенил)-2-пропеноваякислота).Исследуемоесырье,предварительно измельченное массой 2 г (точная навеска) помещали в колбуобъемом 200 мл и добавляли 70 мл воды дистиллированной.
Колбу санализируемойсмесьюприсоединяликобратномухолодильнику иосуществляли нагрев на водяной бане в течение 10- 15 минут. Экстракциюосуществляли повторно. Полученные экстракты охлаждали при комнатнойтемпературе и фильтровали через бумажный фильтр. Извлечения аккуратновносили в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводили объем растворадистиллированной водой до метки. Затем в мерную колбу емкостью 50 млпереносили 1 мл полученного ранее экстракта и доводили объемиспытуемого экстракта до метки с использованием 20% этанола.
Оптическуюплотность испытуемого экстракта измеряли при аналитическом для кислотыкофейной значении длины волны, составляющем 325 нм. Для использованияв качестве раствора сравнения был отобран этанол 20%.Содержание суммы гидроксикоричных кислот (Х, %) в листьях яблонилесной в пересчете на кислоту кофейную вычисляли по формуле:58Х=Ах × 200 × 50 × 1001%Е1см× × × (100 − ),где Ах – оптическая плотность испытуемого извлечения1%Е1см– удельный показатель поглощения кислоты кофейной при 325 нм,составляющий 782m – масса навески измельченных листьев яблони лесной – объем аликвоты, млW – влажность ,%2.2.4.
Изучение состава и оценка суммарного содержания органическихкислотКачественный анализ свободных огранических кислот проводилиметодом ионо-эксклюзионной хроматографии с использованием методики,разработанной А. Н. Кузьменко применительно к исследованию карбоновыхкислот,содержащихсявлекарственномрастительномсырье[51].Пробоподготовка сырья была описана автором для высушенных трав, кор иподземных органов исследованных лекарственных растений.
Учитывая, чтоанализ проводился нами для плодов и листьев различных способовконсервации, пробоподготовка была нами модифицирована и на стадииизмельчения высушенные листья и плоды измельчали в лабораторноймельнице, а свежее и замороженное сырье растирали до кашицеобразноймассы в аптечной ступке, после чего к пробе сырьямассой 2 г.(точнаянавеска), помещенной в лабораторную фарфоровую чашку приливали 20 млводы дистиллированной и нагревали на водяной бане в течение 15 минут,после чего оставляли для охлаждения в течение 30 минут и подвергалицентрифугированию на лабораторной центрифуге (8000 об./мин) в течение 5минут с последующей фильтрацией.59Полученной извлечение исследовали на приборе «Цвет 3006» скондуктометрическим детектором на сорбенте Аminex Q-15S (8 х 300 мм),скорость потока 0,7 мл/мин, с 5 мМ растором бензойной кислоты,используемым в качестве элюента.Идентификацию карбоновых кислот осуществляли путем сравнения свременами удерживания стандартов.Расчет количественного содержания свободных органических кислотопределяли в сравнении титриметрическим методом в пересчете на кислотуяблочную в соответствии с методикой ГФ РФ ХI.2.2.5.
Определение аминокислотного состава листьев, плодов яблонилеснойОпределение состава аминокислот в исследуемых плодах и листьяхяблони лесной проводили по известной методике, пробоподготовка сырья вкоторой предусматривает обработку исследуемого сырья (точная навескаизмельченных листьев, плодов яблони лесной- 50 мг) 25 мл растворадодецилсульфата натрия 0,25% в 0,1 М буферном фосфатном растворе,обеспечивающем значение водородного показателя - 6,5 [67]Исследуемы образцы подвергали инкубированию в лабораторномтермостате в течение 60 минут, контролируя уровень температуры, послечего осуществляли забор образци пипеткой и переносили его на колонкухроматографическую (15 х 1,5 см), заполненную гелем Тoyoperl HW -55 F.Выделение аминокислотных фракций осуществляли в температурномрежиме 25 С.
В качестве элюента применяли 0,25% раствор додецилсульфатанатрияв50мМфосфатномбуфере.Хроматографическийанализисследуемых образцов осуществляля с применением коллектора фракций"multriac" LKB, снабженного детектирующим устройством. Аминокислотныйсосав белковой фракции изучали на приборе Keltec 1030, Швеция. В ампулудля проведения гидролиза амидной связи микрошприцем вводили 10 нМ60раствора концентрата в буфере и проводили упаривание на вакуумном насосес ловушкой, заполненной диметилкетоном с жидким азотом. После чеговносили раствор кислоты хлороводородной, замораживали и запаивали подвакуумом. Пробу термостатировали 24 часа при контроле постоянстватемпературного режима 105ºС. После вскрытия ампулы, содержимоеупаривали, добавляли 0,5 мл воды и снова высушивали, растворяли в 0,7 млсмеси 0,1% трифторуксусной кислоты и 5% ацетонитрила, центрифугировали5 минут при 2000 об/мин и микрошприцем вводили в автосамплераминокислотногоанализатора.Показанияинтегратораприборарасшифровывали по стандартным хроматограммам известных аминокислот.2.2.6.
Определение дубильных веществИдентификациюдубильныхвеществвисследуемомсырьеосуществляли с использованием качественных реакций, традиционноприменяемых для данной группы веществ [29], а также методом ТСХ,рекомендуемымЕвропейскойФармакопеей7изд.Такженамииспользовалась методика ТСХ на пластинках «Сорбфил» 10х15 см,апробированная ранее и показавшая наилучшее разделение полифенольныхсоединений для образцов сырья, рассматриваемых в качестве источникадубильных веществ [5] в системе растворителей: эфир диэтиловый - этановая кислота ледяная – гексан – этилацетат(20:20:20:40) метановая кислота безводная –этилацетат-толуол (10: 30: 60) н-бутанол- этановая кислота –вода (4:1:2) этилацетат – метановая кислота безводная – вода (80:10:10)Обнаружение зон адсорбции разделяемых веществ осуществляли в УФсвете при длине волны 254 и 365 нм, с последующим детектированиемраствором железа аммония сульфата 1% и алюминия хлорида раствором 2%спиртовым.61Результаты проведенного ТСХ анализа были использованы дляформирования показателей подлинности листьев и плодов яблони лесной.Количественное содержание дубильных веществ оценивали в сравнениис использованием титриметрического метода в пересчете на танин испектрофотометрически в пересчете на кислоту галловую.Определение суммарного содержания полифенольных веществ висследуемых объектах осуществляли с использованием методики ФолинаЧикалтеу, описанной ранее для анализа различных растительных объектов.[78,96] Данный метод основывается на использовании аналитическогореактива Фолина – Чикалтеу, представляющего собой смесь фосфорновольфрамовой(P2O5×12WO3×42H2O;M.масса=3680,9)ифосфорномолибденовой кислот (H7P(Mo2O7)6×H2O; M.
масса=1861,28) . Входе реакции, протекающей при взаимодействии полифенольных веществанализируемого объекта и реактива Фолина – Чикалтеу, полифенольныевещества окисляются и формируется интенсивная голубоватая окраска смесивосстановленных вольфраматов и молибдатов. Оптическая плотностьизвлечения оказывается пропорциональной содержанию полифенольныхвеществ. Нами использовалась пробоподготовка, широко используемая прианализе пищевого и лекарственного растительного сырья [96].Параллельно анализу объектов исследования осуществляли измерениеоптической плотности раствора, приготовленного нами из 1 мл РСО галловойкислоты, 5 мл свежеприготовленного реактива Фолина – Чикалтеу, 15 мл20% раствора натрия карбоната и воды, дистиллированной до 100 мл.Суммарное содержание полифенольных соединений в % в пересчете накислоту галловую вычисляли по формуле:Х=D ×m0 ×100×1×100×100×100D0 ×m×a×100×100×(100−w), гдеD – оптическая плотность исследуемого раствора62D0 – оптическая плотность раствора РСО галловой кислотыm – масса сырья, гm0 – масса РСО галловой кислоты,га – аликвота раствора А, млw – потеря в массе при высушивании сырья, %2.2.7.
Определение полисахаридовКак известно, в пищевой промышленности плоды яблони домашнейшироко используются для производства яблочного пектина, качествокоторого характеризуется требованиями ГОСТ 29186 – 91 «Пектин». Приэтом в работах многих исследователей для плодов яблони разных видовпроводитсяколичественноеопределениесуммарногосодержанияполисахаридов [11,67]. Мы сочли целесообразным провести сравнительныйанализ содержания полисахаридов в сырье по фармакопейной методике ГФХI,модифицированнойдляанализаплодовилистьевяблони,представленных свежим, высушенным и замороженных сырьем, а такжепровести анализ содержания водорастворимых и нерастворимых пектинов висследуемомсырье,поизвестнымметодикам,применяемымдляколичественной оценки содержания пектиновых веществ в растительномсырье [61,71].Оценку количественного содержания полисахаридов в плодах и листьяхяблонилеснойпроводилигравиметрическимметодом,послепробоподготовки включающей измельчение аналитической пробы свежихили замороженных плодов, или листьев яблони лесной до пюре-образногосостояния путем истирания в ступке, а для высушенного сырья измельчениевлабораторноймельнице.Точнуюнавескуизмельченныхсвежих.Высушенных или замороженных плодов, или листьев яблони леснойпомещали в колбу со шлифом объемом 250 мл, приливали 200 мл воды,дистиллированной и нагревали до кипения с обратным холодильником на63водяной бане в течение получаса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
