Диссертация (1141249), страница 10
Текст из файла (страница 10)
8 Спектры поглощения РСОСпектры поглощения извлечений из травы звездчатки представленына рис. 9641 – спектр поглощения веществс временем выхода 1,9558;2 – с временем выхода 2,2552;3 – с временем выхода 2,6316;4 – с временем выхода 3,01051 – спектр поглощения веществс временем выхода 14,3906;2 – с временем выхода 14,8889;3 – с временем выхода 14,9913;4 – с временем выхода 15,17561 – спектр поглощения веществс временем выхода 10,9323;2 – с временем выхода 13,0935;3 – с временем выхода 13,6431 – спектр поглощения веществс временем выхода 16,0836;2 – с временем выхода 16,3259;3 – с временем выхода 17,1827;4 – с временем выхода 17,94381–спектр поглощения веществ1 – спектр поглощения веществс временем выхода 18,4763;с временем выхода 22,3778;2–с временем выхода 18,6672;2 – с временем выхода 23,9001;3–с временем выхода 20,084;3 – с временем выхода 29,0854–с временем выхода 21,05Рис.
9 Спектры поглощения извлечений из сырья65Из анализа спектров поглощения растворов стандартных образцов иводно-спиртовыхизвлеченийизтравызвездчаткисредней,чтопредставлены на рис. 8 и 9, имеют место совпадения характеров спектров вобласти от 200 до 360 нм. Это позволяет полагать, что при детектированиихроматографического процесса при длине волны 210 – 300 нм можноидентифицировать соединения как высокополярные, так и малополярные.В то же время детектирование при длине волны 255 нм позволяетвыявить и качественно оценить содержание витамина В1, аскорбиновой,галловой,эллаговойкислот,суммарноесодержаниефлавоноидов,кумаринов.Сущность методики состоит в том, что предварительно проводяточистку водно-спиртового извлечения травы звездчатки (раствор А) путемфильтрованиячерезмикропористыйфильтр,отбрасываяпервыемиллилитры фильтрата.Очищенный испытуемый раствор и раствор модельной смеси РСОвитаминаВ1 ,ксантоксинахроматографеаскорбиновой,икверцетинавысокогогалловой,эллаговойхроматографируютдавления,кислот,нарутина,жидкостномукомплектованномсистемойградиентной подачей элюента, УФ диодноматречным детектором или сперестраиваемой длиной волны, а также компьютерной системой сборки иобработки данных.
Вычисляют площади пиков растворов стандартныхобразцов и площади пиков испытуемого образца. Получают не менее пятихроматограмм для каждого из растворов в следующих условиях:- колонка 250 на 4,6 мм; сорбент Сromosil 100-5C18 с размеромчастиц 5 мкм;- температура термостата 380 С;- длина волны детектирования 255 нм;- подвижная фаза: ацетонитрил (А), 0,1 % раствор фосфорнойкислоты (В);66- режим элюирования№этапа0Продолжительность Раствор А,%этапа, мин.104Раствор В, %Режим95Изократ.1406415К=1258515Изократ.- скорость элюирования 1000 мкл/мин;- время регистрации 45 минНа рис. 10, 11 представлены хроматограммы водно-спиртовогоизвлечения из травы звездчатки средней и РСО модельной смеси.Рис.
10 – Хроматограмма РСО модельной смеси.67Рис. 11. Хроматограмма водно-спиртового извлечения из травызвездчатки средней и РСО модельной смеси1-витамин В 1 (вр. выхода 1,1 мин); 2-аскорбиновая кислота (вр.выхода 2,7 мин); 3-галловая кислота (вр. выхода 11,8 мин); 4-эллаговаякислота (вр. выхода 18,5 мин); 5-рутин (вр. выхода 21,0); 6-ксантотоксин(вр. выхода 24,0 мин); 7-кверцетин (вр. выхода 29,9 мин).Идентификацию компонентов проводят по характеру совместимостиспектров поглощения каждого хроматографического пика и по времениудерживания РСО стандартных образцов.Врезультатепроведенныхисследованийидентифицированыосновные биологически активные вещества травы звездчатки средней:витамин В 1; аскорбиновая кислота; галловая кислота; эллаговая кислота;рутин; кверцетин; ксантотоксин.4.2.Исследованиекачественногосоставафлавоноидныхсоединений в траве звездчатки средней.Для создания нормативной документации на траву звездчаткисредней нам так же необходимо исследовать химический состав68изучаемого сырья.
Относительно содержания флавоноидов в литературеимеются немногочисленные и противоречивые данные. Так, ПастушенковЛ.В. с соавторами [74] сообщает, что звездчатка средняя содержитфлавоноиды витексин и сапониретин и другие флавоноиды. Приисследовании лекарственной флоры Советского Дальнего Востока вразличных видах звездчатки указывается на присутствие флавоноидов безуказания качественного состава и количественного содержания [118].Также в литературе имеется только указание на присутствие флавоноидовв звездчатке средней [67].
Горина Я.В. [19], исследуя некоторые виды родаStellaria, сообщает о следовых количествах флавоноидов или об ихотсутствии. Учитывая вышеизложенное, целью данного исследования былподбор условий и разработка методики определения химическогофлавоноидного состава травы звездчатки средней методом ВЭЖХ/МС.Готовое сырье анализировали с помощью метода ВЭЖХ/МС.Методика. 4 г высушенной травы, измельченной до размера частиц,проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, помещают вкруглодонную колбу вместимостью 250 мл. Прибавляют 60 мл 70 %этанола, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают накипящей водяной бане в течение 45 мин.
После охлаждения фильтруютчерез бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл так, чтобысырье не попало на фильтр. В круглодонную колбу со шротом прибавляют40 мл 70 % этанола и нагревают на кипящей водяной бане с обратнымхолодильником в течение 15 мин. После охлаждения извлеченияфильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Колбу и осадок нафильтре промывают 5 мл 70 % этанола и доводят объем раствора в мернойколбе до метки (извлечение).Прианализеизвлеченийиспользованаультраэффективнаяжидкостная хроматография /МС. Исследование проводят на хроматографеWaters Acquility с тандемным квадрупольным МС-детектором TQD69(Waters).
Подвижная фаза А (ПФ А). Смесь вода - ацетонитрил (95:5) смуравьиной кислотой.Подвижная фаза В (ПФ В). Ацетонитрил с муравьиной кислотой.Хроматографируют испытуемый раствор 2, приготовленный как указановыше, в следующих условиях:- объем пробы 1 мкл;- колонка 0,21 х 5,0 см Acuility UPLC BEH C18 (1,7 мкм);- температура колонки 350 С;- скорость потока 0,5 мл/мин;- градиентный режим хроматографирования формируется путемсмешивания подвижных фаз А и В по следующей схеме:Время, минПФ А, %ПФ В, %09553,060403,1955- МС детекция в режиме позитивных ионов;- параметры детектора: напряжение на капилляре – 3 кВ; напряжениена конусе – 55 В; температура капилляра 4500 С; температура источника1200 С; скорость потока осушающего газа 800 л/ч; скорость потока газа вконусе 50 л/ч и сканирование в диапазоне масс от 100 до 1000 ед.Полученные результаты представлены на хроматограммах.
На рис.12 даны результаты анализа извлечения из травы звездчатки среднейметодом ВЭЖХ/МС.Флавоноидный состав экстракта методом ВЭЖХ/МС.7020mg/ml zvezdQBA127DMP-030713-2 243 (2.211) Cm (239:249-250:258)OHOHO771.74651.43433.38177.04OOHOOOOHOHHOOHHOOHOHOHOHOH3 COHOOH%OOOHOOOOHO1204.89HOOHHOOHHOOHOHOHOH1.501.560.440.50OH3 C1.00DMP-030713-2100DMP-030713-2 196 (1.783) Cm (193:200-(182:189+203:211))OH433.31HO313.32OH%OHOHOH922.85 1108.351426.110DMP-030713-2 159 (1.446) Cm (154:166-170:179)433.38100HOOOOO%595.44 757.39OHOOOHOHOHMarginatoside1: Scan ES+1.93e6457.31595.30758.30955.472.0e-10.0m/z400600800100012003.001: Scan ES+7573.06 1.75e71.502.502.212.382.003.001: Scan ES+7711.14e72.792.503.001: Scan ES+9332.16e72.43 2.702.200.501316.8202002.000AU173.551.001.00DMP-030713-2%1002.502.351.951.50DMP-030713-2100DMP-030713-2 148 (1.346) Cm (141:150-121:134)3.001: Scan ES+5952.06e72.712.212.001.380.501112.62884.772.50%%HOOHHO198.241.000.470OHHOOH1.781.50DMP-030713-2100OHO313.111.982.222.000.771.010.501: Scan ES+3.00e63.001: Scan ES+4572.77e72.711.460OH1.00DMP-030713-2100OOH1.501.060.50OHOOHO0.4501.99e6OHO595.58732.68O%1003.001: Scan ES+4332.94e72.501.45%02.001.350OHO1.00DMP-030713-2100O%HO771.39475.57207.262.501.781.642.06 2.39 2.700.980.501: Scan ES+1.22e6933.421002.001.430DMP-030713-2 228 (2.075) Cm (225:234-211:221)1.501001260.47OH1.00DMP-030713-2OOHO1: Scan ES+3132.612.843.072.20e72.240.980.50OH000.440OO03-Jul-2013 03:25:001.46 1.78%%1: Scan ES+1.18e6933.77100QBA127DMP-030713-210003-Jul-2013 03:25:00%20mg/ml zvezd1.502.002.503.002: Diode Array3352.19Range: 2.299e-11.76Time1.502.002.503.001.430.310.5014001.00Рис.
12. Хроматограмма извлечения из травызвездчатки средней методом ВЭЖХ/МС.Длячетырехиз5-тимажорныхкомпонентовэкстрактапредполагается одна из возможных структур на основании фрагментацииионов. Показательно, что ни в одном из пиков не наблюдаетсяфрагментация до аглюкона.Схема фрагментации пика с временем удерживания 1,43 мин:OHOOHOOHOOHHOOHOOOHOOHHOHOOHOHOOHHOOOHOHOOOHMarginatosideOOHOOHOOOHOHOOHOHOOHvitexinHOOHM+H=757OHOHOHM+H=495OHM+H=433HOOOCH3M+H=313OHАналогичная схема фрагментации пика с временем удерживания 1,76мин:OH71OHOOHOOHHOOHOOOHOOOHOHOOHOHOOHM+H=495OHOHOHHOvitexinHOOHOOOCH3M+H=433OHOHM+H=313OHДва пика с молекулярным ионом 933 отличаются только временемудерживанияисовпадаютпосхемамфрагментации.Можнопредположить, что структурное различие этих соединений обусловленоразличием углеводного фрагмента (включает фрагменты глюкозы, или,например, галактозы, или положением метильной группы – при 2-ом или3-ем остатке глюкозы, и т.д.):OHOHHOHOOOOOOOOHOHHOOHHOOHHOOHOOHOHH3CM+H=933OOOHOOOHHOOHOHHOOHHOOHOHOHOH3COOHOHHOOHOHOOHOOHOOHOOOHOOOM+H=433M+H=771Структура пика с временем удерживания 1,35 мин неизвестна.Рис.
13. Анализ флавоноидов в траве звездчатки средней.Из травы звездчатки выделено и установлен состав 5 флавоноидныхсоединений.72OH7HOOHHOOOHOHOOHOOOHOOHHOOHOOOOOHHOHOOHOCH 3Mr 933Mr 933I)4’,5,7-тригидрокси-8-(β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-Dглюкопиранозил-(1→6)-3-O-метил-β-D-глюкопиранозил(1→6)-β-D-глюкопиранозил)флавонII)2-(4-гидроксифенил)-8-(β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-Dглюкопиранозил-(1→6)-3-О-метил-β-D-глюкопиранозил(1→6)-β-D-глюкопиранозил)-5,7-дигидрокси-4Н-1бензопиран-4-онРис. 14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
