Диссертация (1141249), страница 13
Текст из файла (страница 13)
К высушенной пробе добавляют 20 мкл 0,5М раствора РМР (1-фенил-3-метил-5-пиразолона) в метаноле и 20 мкл0,3 М раствора гидроксида натрия, тщательно встряхивают на Vortex итермостатируют при 700 С в течение 2 часов. Пробу нейтрализуют 20 мкл0,3 М раствором кислоты хлористоводородной и дважды экстрагируютизбыток реагента РМР 50 мкл бензола. Остаток упаривают на SpeedVac сподогревом и растворяют в 500 мкл смеси ацетонитрил-вода всоотношении 1:9. Содержание связанных сахаров определяют методомкапиллярного электрофореза. Отношение пиков и расчеты концентрацийуглеводов проводили по внутреннему (гликозамин) и внешнему стандарту- смесь пяти анализируемых углеводов в концентрации 1 г/л.
Результатыпредставлены в табл. 8 и рис. 20 и 21.90Таблица 8Содержание связанных углеводов в траве звездчатки средней.№Содержание связанных сахаров, %обраПентозыГексозыОбщаягалактоза суммасуммазцаарабинозаксилоза12,10,72,83,062,15,167,9622,20,52,73,002,35,308,0032,30,73,03,202,55,258,25сумма глюкозаСвязанные сахара в траве звездчатки представлены: арабинозой –2,1-2,3; ксилозой - 0,5-0,7; глюкозой – 3,00-3,20; галактозой – 2,1-2,5.400320240d-galactose-PMPd-arabinose-PMPResponse480glucose-PMPd-xylose-PMPdad1A.chglucosamine-PMPd-mannose-PMPОбщее содержание связанных сахаров 7,96-8,00 %.1608005NametR(min)d-mannose-PMP5.56glucosamine-PMP7.56glucose-PMP9.91d-xylose-PMP11.06d-galactose-PMP12.64d-arabinose-PMP 13.551015Retention Time (min)Peak AreaArea Percent203.982e+617.1Рис.
20 Хроматограммасмеси стандартов.2.435e+63.700e+64.478e+63.116e+64.294e+610.415.919.213.418.491dad1A.chglucosamine-PMP55504540201510505NametR(min)d-mannose-PMP5.57glucosamine-PMP7.57glucose-PMP9.91d-xylose-PMP11.07d-galactose-PMP12.65d-arabinose-PMP 13.53d-galactose-PMPd-arabinose-PMP25glucose-PMPd-xylose-PMP30d-mannose-PMPResponse3510Retention Time (min)1520Peak AreaArea Percent2.751e+4 гидролизата0.8Рис. 21 Хроматограмма1.673e+648.4извлеченияиз травызвездчатки.1.038e+53.01.865e+40.55.467e+41.6Рисунок 21 подтверждает7.519e+4наличие 2.2в траве звездчатки арабинозы,ксилозы, глюкозы и галактозы.5.2. Исследование аминокислотного состава звездчатки средней.Многие лекарственные свойства звездчатки средней обусловленыналичием в ней таких БАВ как аминокислоты.
В литературе нами не былообнаружено достаточно информации об аминокислотах.Поэтому на следующем этапе нашего исследования было: изучитькачественный состав и количественное содержание аминокислот в травезвездчатки средней.Исследование проводили по стандартной методике.Методика. Аналитическую пробу сырья звездчатки измельчают доразмера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,5 мм.Пробу массой 1,0 г (точная навеска) помещают в круглодонную колбу сошлифом, прибавляют 20 мл 70 % этанолом, взвешивают с точностью92± 0,01 г и нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение1 часа.
Затем охлаждают до комнатной температуры, взвешивают и принеобходимости доводят 70 % этанолом до первоначальной массы.Полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр. Первые 10 млфильтрата отбрасывают. Из последующей порции элюата отбирают 50 мкли упаривают досуха в вакуумном испарителе фирмы «Servanta» (США).Сухой остаток растворяют в 200 мкл 0,1 М раствора кислотыхлористоводородной, нагревают на водяной бане в течение 15 мин притемпературе 600 С, перемешивают и центрифугируют в течение 3 мин при4000 оборотах. Для анализа используют 50 мкл полученного гидролизата.Аминокислотный анализ водорастворимых фракций проводили нааминокислотном анализаторе фирмы «Хитачи» модель 835 на стальнойколонке (0,4 х 15 см), заполненной катионообменной смолой марки 2619(Hitachi Custom lon-Exchange Resin).
Разделение аминокислот проводилосьв трех буферных системах натрий - цитратных буферных растворов: 0,18 НрН 3,25; 0,3 Н рН 3,9; 1,6 Н рН 4,75. Нингидриновый реактив приготовлялис использованием метилового эфира этиленгликоля. Цитратные буферныерастворы подавали в колонку по стандартной программе со скоростью32 мл/час. Нингидриновый реактив подавали со скоростью 20 мл/час.После выхода из аналитической колонки разделенные аминокислотысмешивались нингидриновым реактивом в смесительном блоке всоотношении 2:1. Реакция аминокислот с нингидриновым реактивомпроходила за 4 мин при 1000 С в реакционной бане. Колориметрическоеизмерение окрашенных комплексов, образующихся в результате реакции снингидрином, проводится непрерывно и одновременно при двух длинахволн. Первичные амины образуют пурпурную окраску, измеряемую придлине волны 570 нм, а вторичные (пролин и оксипролин) образуютсоединения желтой окраски, измеряют при длине волны 440 нм.93Результатыкачественногоиколичественногоопределенияаминокислот в сырье звездчатки средней представлены на рис.
22 и в табл.9.Рис. 22 1 - Хроматограмма стандартных растворов аминокислот.2 – Хроматограмма извлечений из травы звездчатки средней.С помощью хроматограммы возможно установить качественныйсоставаминокислотвзвездчаткесредней,которыйподтвержденколичественным анализом.Таблица 9.Содержание аминокислот в сырье звездчатки средней.АминокислотыСодержание,%Аспарагиновая кислотаТреонинСеринПролинГлютаминовая кислотаАланинГлицинВалинМетионинИзолейцинЛейцинТирозинФенилаланинОксилизинЛизинГистидин0,1330,0950,0420,0910,1890,0400,0430,0490,0090,0270,0410,0210,0160,0510,0160,013Процент от суммысвободных кислот15,452,904,8810,5721,944,654,995,691,053,144,762,441,865,921,861,5194АргининОксипролинЦистинЭтаноламинСумма0,0240,0250,0010,0050,8612,792,900,120,58100,0Как следует из эксперимента в траве звездчатки средней содержится20 аминокислот.Преобладающими кислотами в траве звездчатки средней являютсяглютаминовая кислота – 21,94 %, аспарагиновая кислота – 15,45 %, пролин– 10,57 %, оксилизин – 5,92 %, валин – 5,69 %, от суммы свободныхкислот.Достаточновысокоесодержаниетакихжизненноважныхаминокислот, как глицин – 4,99 %, серин – 4,88 %, лейцин – 4,76 %, аланин– 4,65 % от суммы свободных кислот.
Звездчатка способна оказыватьразностороннее фармакологическое действие.5.3. Количественное определение витамина С и витамина В1 втраве звездчатки средней методом ВЭЖХ.В доступной литературе нами не найдено было сведений околичественном содержании аскорбиновой кислоты (витамина С) итиамина гидрохлорида (витамина В1). В связи с этим и была поставленазадача разработки методик количественного определения витамина С ивитамина В1 в траве звездчатки средней.СогласногосударственнойфармакопееХиздания[20]количественное определение аскорбиновой кислоты в плодах шиповникапроводят путем титрования раствором 2,6 – дихлорфенолиндофенолятанатрия. Однако применение этого титранта приводит к получениюнедостаточно воспроизводимых и точных результатов анализа, чтовызвано неустойчивой окраской в титрованном растворе. Из физико-95химическихметодовобычноэкстракционно-фотометрический,используютфотоколориметрический,УФ-спектрофотометрическийсхроматографией в тонком слое сорбента [35, 92].Наше внимание привлекла методика количественного определенияаскорбиновой кислоты в плодах шиповника методом ВЭЖХ [102].В качестве стандартов, при определении использована аскорбиноваякислота фирмы Sigma (A5960), тиамина гидрохлорид фирмы Sigma(Т4625).
При подборе условий экстракции витаминов С и В1 из травызвездчатки средней было установлено, что оптимальный выход витаминовС и В1 наблюдается при измельчении сырья 2 мм, экстрагент 70 % этанол,соотношение сырья и экстрагента 1:50, время экстракции 1 час30 мин прикомнатной температуре. Полученные результаты были использованы присоставлении методики количественного определения витаминов С и В 1 втраве звездчатки средней [82].Методика.Около2,0г(точнаянавеска)травызвездчатки,измельченной до размера частиц, проходящих сквозь сито сдиаметромотверстий2мм,помещаютвкруглодоннуюколбувместимостью 250 мл, добавляют 60 мл 70 % этанола и взбалтывают навибрационном аппарате в течение 1 часа.
Затем извлечение фильтруютчерез бумажный фильтр в колбу вместимостью 100 мл, следя за тем, чтобычастицы сырья не попали на фильтр. В колбу, в которой проводилиизвлечение, добавляют 40 мл 70 % этанола и извлекают в течение 30 мин.Извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу. Шрот,фильтр промывают 10 мл 70 % этанолом и доводят объем раствора дометки в колбе 70 % этанолом (раствор А).5 мл испытуемого раствора А фильтруют через микропористыйфильтр с диаметром пор 0,45 мкм, отбрасывают первые 2 мл фильтрата.Фильтрат (испытуемый раствор Б) хроматографируют с помощьювысокоэффективного жидкостного хроматографа не менее 5 повторений.96По 10 мкл раствора Б, раствора РСО аскорбиновой кислоты ираствора РСО тиамина гидрохлорида по отдельности вводят в жидкостнойхроматографвысокогодавления,укомплектованногосистемойградиентной подачи элюента, УФ-диозиметрическим детектором спеременной длиной волны, а так же комплексной системой сборки иобработки данных и хроматографируют при условиях приведенных ниже:- колонка 250 х 4,6 мм, заполненная сорбентом Cromosil 100-5С+8 сразмером частиц 5 мкм;- температура термостата 380 С;- длина волны детектирования 255 нм;- подвижная фаза: ацетонитрил (А), 0,1 % раствор фосфорнойкислоты (В);- режим элюированияNПродолжительностьРаствор А,Раствор В,Режимэтапаэтапа%%010495изократ1406415К=1258515изократ- скорость элюирования 1000 мкл/мин;- время регистрации 6 мин.Содержание витамина С или витамина В1 в % на абсолютно сухоесырье (Х) вычисляют по формуле:Х= S обр.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
