Диссертация (1141249), страница 12
Текст из файла (страница 12)
4 показывают, что содержание флавоноидов в травезвездчатки практически не зависит от места произрастания, т.к. образцы,заготовленныевприблизительноМосковскойодинаковоеиТамбовскойсодержаниеобластях,флавоноидов.Неимеютзависитсодержание флавоноидов в траве звездчатки и от времени заготовки. Так,образцы Пермского края, заготовленные в разные месяцы, также имеютпрактическиодинаковоесодержаниефлавоноидов.Содержаниефлавоноидов в траве звездчатки зависит от стадии вегетации: травузвездчатки средней необходимо заготавливать во время цветения и вначале семяобразования.Результаты определения флавоноидов в разных органах звездчаткисредней представлены в табл. 5Таблица 5Содержание флавоноидов в разных частях растения звездчаткисредней.Содержание флавоноидов, %корнистеблилистьяцветки с семенами0,0660,0980,6280,106Как показывают результаты табл.
5, наибольшее содержаниефлавоноидов в листьях звездчатки, наименьшее – в корнях.Содержание флавоноидов по стадиям вегетации представлены втабл. 6Таблица 6Содержание флавоноидов в траве звездчатки средней по стадиямвегетации.Название стадии вегетацииНачало стадии вегетации (5-6 листочков)Начало цветенияКонец цветения и нач семяобразованияСодержание флавониодов, %0,4470,2450,72082Из табл. 6 видно, что наибольшее содержание флавоноидов наконечнойстадиивегетации–вконцецветенияивначалесемяобразовании, когда достаточно развиты листья, которые определяютсодержание флавоноидов в сырье.
В начальной стадии вегетациифлавоноидов больше, чем на второй стадии – в начале цветения. Этосвязано с тем, что в начальной стадии вегетации развиты только листья, аво второй стадии вегетации развиты стебли. В них флавоноидовзначительно меньше, чем в листьях.Анализируяполученныеданные,можнозаключить,чторазработанная нами методика может быть использована для анализа травызвездчатки средней, т.к. методика обладает достаточной точностью ивоспроизводимостью. Помимо этого, с помощью разработанной методикивозможно определить малые количества флавоноидов в сырье звездчаткисредней.Выводы к IV главе.1.МетодомВЭЖХустановленыоптимальныеусловияхроматографирования БАВ в извлечениях из травы звездчатки средней.Дифференциальныеобластидетектированияхроматографическогопроцесса, подвижная фаза, хроматографическая колонка, температуратермостата, режим элюирования, время регистрации хроматограммы.
Спомощью метода ВЭЖХ разработана методика, позволяющая объективнои достоверно определять присутствие доминирующих БАВ в травезвездчатке средней: витамин В1, аскорбиновую, галловую, эллаговуюкислоты, рутин, ксантотоксин, кверцетин.2. Методом ВЭЖХ из травы звездчатки средней впервые выделено 3неизвестныхранеефлавоноидныхсоединения.СпомощьюМСустановлено их химическое строение: 1). 4,5,7-тригидрокси-8-(β-D-83глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил-(1→6)-3-О-метил-β-Dглюкопиранозил) флавон; 2). 4,5,7-тригидрокси-8-(β-D-глюкопиранозил(1→6)-β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил) флавон; 3).
4,5,7тригидрокси-8-(β-D-глюкопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозил) флавон.3. Подтверждено присутствие флавоноида витексина в травезвездчатки средней; также можно предположить, что содержится изомервитексина сапонаретин, т.к. при фрагментации ионов пиков со временамиудерживания 1,43 и 1,76 получается практически одно и то же вещество.4. Разработана методика количественного определения флавоноидовв траве звездчатки средней, основанная на комплексообразованиифлавоноидов с алюминия хлоридом и измерении оптической плотности наспектрофотометре, с помощью которой возможно определять небольшоеколичество флавоноидов с достаточной точностью и воспроизводимостью.Относительная ошибка определения при доверительной вероятности 0,95не превышает ± 4,5 %.5.
Выявлено, что содержание флавоноидов в траве звездчаткисредней зависит от стадии вегетации, а не от места её произрастания ивремени заготовки. Траву звездчатки средней следует заготавливать впериод полного цветения и начале семяобразования: в этот периоднаибольшее содержание флавоноидов. При исследовании разных частейзвездчатки средней (корней, стеблей, листьев и цветков с семенами)установлено, что наибольшее содержание флавоноидов в листьях, анаименьшее – в корнях.84ГЛАВА5.ОПРЕДЕЛЕНИЕУГЛЕВОДОВ,АМИНОКИСЛОТ,ВИТАМИНОВ И САПОНИНОВ В ТРАВЕ ЗВЕЗДЧАТКИСРЕДНЕЙ (МОКРИЦЫ).5.1 Определение углеводовВ доступной литературе нами не было найдено сведений окачественном и количественном содержании сахаров в траве звездчаткисредней (мокрицы). В учебной и справочной литературе указывается насодержание углеводов, но без указания их состава и количества.
Однако,знать качественный состав и количественное содержание их необходимо,т.к. углеводы способствуют проникновению действующих веществ вклетки организма и усиливают действие лекарственных препаратов,полученных из звездчатки средней [44, 100].Целью работы было: разработать методики качественного иколичественного определения углеводов и установить качественныйсостав и количественное содержание углеводов в траве звездчаткисредней.В готовом сырье определяли качественный состав углеводовпоэтапно.
На первом этапе идентифицировали сахар с помощьюкачественных реакций; на втором этапе определяли сахара с помощьюхроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ); на третьем этапеопределяли качественный и количественный состав углеводов с помощьюметода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).5.1.1. Исследование качественного состава углеводов в травезвездчатки средней.Для разработки методики установления качественного состава травызвездчатки были изучены условия экстракции углеводов из травы иочистка извлечения от полифенольных соединений.85Оптимальными условиями экстракции являются: измельченностьсырья 2 мм, экстрагент 40 % этанол, соотношение сырья и экстрагента1:50, нагревание на кипящей водяной бане 60 мин (45 и 15 мин). Отполифенольныхсоединенийосвобождалисьпутемпропусканияизвлечения через стеклянную колонку диаметром 1 см с 3 г алюминияоксида для хроматографии II степени активности.Методика.
5 г травы, измельченной до размера частиц, проходящихсквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, помещают в круглодоннуюколбу, прибавляют 60 мл 40 % этанола и нагревают на кипящей водянойбане с обратным холодильником в течение 45 мин. После охлажденияизвлечениефильтруютчерезватныйтампонвмернуюколбувместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют с 40 мл 40 % этанолом втечение 15 мин, после охлаждения фильтруют в ту же мерную колбу.Объем раствора в колбе доводят 40 % этанолом до метки и перемешивают.Извлечение упаривают под вакуумом до 30 мл (раствор А).Для очистки от полифенольных соединений 15 мл раствора Апропускают через колонку диаметром 1 см с 3 г алюминия оксида дляхроматографии II степени активности – получают очищенное водноеизвлечение (раствор Б).В начале мы определяли свободные сахара.
Для этого использовалиреакцию Бертрана с реактивом Фелинга. К 1 мл раствора Б прибавляют 1мл жидкости Фелинга (смесь реактива 1 и реактива 2) и нагревают накипящей водяной бане. Реакция положительна – свободные сахараприсутствуют в сырье.Затем определяли наличие в сырье связанных сахаров. К 1 млраствора Б прибавляют 1 мл кислоты серной разведенной и нагревают накипящей водяной бане в течение 5 мин (раствор В). После охлаждения к 1мл гидролизата добавляют 1 мл жидкости Фелинга и нагревают накипящей водяной бане. Наблюдается выпадение красно-оранжевого осадка86– меди (I)оксида. Из этого следует, что в траве звездчатки среднейсодержатся и связанные сахара.Полученные данные подтверждены методом ТСХ на пластинкахСорбфил ПТСХ-АФ-УФ.
Хроматографирование проводили в системерастворителей: 95 % этанол; 70 % этанол; вода; изопропанол-вода (3:1);изопропанол-вода (4:1) [44, 115].На линию старта одной хроматографической пластинки наносили по0,001 мл раствора В и 5 % раствора фруктозы, на вторую – по 0,001 млраствора Б и 5 % раствора глюкозы. После прохождения фронтомрастворителей 12 см пластинки вынимали из камеры, высушивали навоздухе.Пластинкуобрабатывалидетектирующимиреагентами:антроновым реактивом, резорциновым реактивом и дифениламиновымреактивом [132].Хроматограммупервойпластинкипогружаютвреактив1антронового реактива, высушивают на воздухе, затем опрыскиваютреактивом 2 антронового реактива и нагревают в сушильном шкафу притемпературе 1080 С в течение 6 мин.
Реактив является специфичным накетозыипентозы.Моно-, ди-, три-полисахариды,содержащиекетогексозы дают желтую окраску, кетопентозы – пурпурную, кетогептозы–оранжево-желтую.использованиисистемыНаилучшееразделениерастворителейнаблюдалосьизопропанол-вода(4:1)при–извлечение из сырья дает пятно желтого цвета, совпадающее по значениюRf с пятном фруктозы (Rf 0,68). При опрыскивании хроматограммырезорциновым реактивом, также специфичным на кетозы, с последующимнагреванием при температуре 9000 С в течение 10 мин, наблюдалось пятнорозового цвета аналогичной формы и расположения.Приопрыскиваниихроматограммывторойпластинкидифениламиновым реактивом, специфичным для альдоз (альдогексозыдают коричневое окрашивание, альдопентозы – пурпурное), извлечение из87сырья дает пятно серо-коричневого цвета, совпадающее по значению спятном глюкозы (Rf 0,61).Таким образом, в траве звездчатки средней обнаружены сахара:фруктоза и глюкоза.На третьем этапе изучали качественный и количественный составуглеводов в траве звездчатки методом ВЭЖХ.
Свободные сахараопределяли по следующей методике: к 100 мг измельченного сырьядобавляют 1 мл воды в пробирку с завинчивающейся пробкой, нагреваютпри 900 С до набухания сырья и экстрагируют углеводы в течение 1 часапри температуре 250 С при встряхивании. Полученное извлечениецентрифугируют 10 мин при 14000 об/мин, добавляют активированныйуголь, встряхивают и снова центрифугируют 10 мин при 14000 об/мин.Аликвоту 20 мкл супернатанта анализировали методом прямофазнойВЭЖХ на колонке Liena NH2 4,6 х 250 mm (5 mm) или аналогичной сподвижной фазой: ацетонитрил – вода (70:30) при скорости потока 1мл/мин, при комнатной температуре с рефрактометрической детекцией.Отнесение пиков и расчет концентраций углеводов проводят по внешнемустандарту,содержащемусмесьдвуханализируемыхуглеводовиглицерина в концентрации 10 г/л.
Результаты определения свободныхсахаров представлены в табл. 7 и рис. 17 и 18Таблица 7Результаты определения свободных сахаров в траве звездчаткисредней.№образца Глицерол,%Содержание углеводов, %Глюкоза,%Фруктоза,%Общая сумма,%10,130,320,520,9820,150,330,551,0330,110,350,530,9988В результате проведенных исследований установлено в травезвездчатки наличие глицерола 0,11 – 0,15 %, глюкозы 0,32 – 0,35 %,фруктозы 0,53 – 0,55 %. Общее содержание свободных углеводов 0,98 –1,03 %.Результаты анализа свободных углеводов:2200fructose180016001400glucose12001000sucroseGlycerol200080060040020002Name468Retention Time (min)tR(min)Peak Area Area Percentfructose6.578.279e+625.7glucose3500sucrose7.207.571e+623.58.698.318e+625.81012Рис. 18 Хроматограмма4.778.055e+6 смеси25.0стандартовGlycerol30002500200015001000500002468Retention Time (min)NametRPeak Area Area Percentunknown6.151.039e+61.8unknown6.422.205e+738.6unknown7.444.587e+68.0unknown8.404.395e+67.7unknown9.487.285e+612.7unknown11.611.782e+731.21012(min)Рис.
19 Хроматограммаизвлечения из травы звездчатки89Результаты рис. 18 и 19 подтверждают наличие в свободном виде втраве звездчатки глицерола, глюкозы и фруктозы.Для анализа связанных сахаров водные извлечения гидролизуют 1 мл1М раствором кислоты хлористоводородной при 1000 С в течение 2,5часов. После исчерпывающего гидролиза центрифугируют 10 мин при14000 об/мин. К 0,8 мл супернатанта добавляют 7,2 мл воды, растворпропускают через прямофазный концентрирующий патрон (Диасорб С16),отбрасывают первые 3 мл и собирают следующий 1 мл. К 20 мкл растворасмеси стандартов в концентрации 1 г/л каждого углевода (внешнийстандарт)ивнутреннегоисследуемогостандартараствора(раствордобавляютглюкозамина)20имклраствораупариваютнавакуумированном центрифужном испарителе типа SpeedVac с подогревомв полипропиленовой пробирке.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
