Диссертация (1140833), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Иммуногистохимический метод исследованияПолучение биопсийного материала очагов актинического кератоза ибазально-клеточного рака кожи: под местной анестезией 2% растворомлидокаина проводилась биопсия кожи размером 0,5x0,5 см. Биоптатыфиксировали в 10% растворе формалина, забуфференом по Лилли при рНОбразцы здоровой кожи были получены в ходе хирургического7,4.вмешательства (абдоминопластика, блефаропластика).Для выявления экспрессии ММП-1,9 в очагах АК, БКР, а также в образцахкожи с дерматогелиозом I-IV стадий использовали парафиновые срезы толщиной5 мкм, нанесенные на предметные сиалинизированные стекла ("Dako") иинкубированные с моноклональными антителами ("Novocastra") к ММР-1 1:10,ММР-9 1:40.
Для визуализации применялась система детекции "Envision"("Dako").Вкачествехромогенаиспользовалсядиаминобензидин.Длявосстановления антигенной активности срезы обрабатывали в специализированном миниавтоклаве "Retrivale-2100" при температуре 12 градусов Цельсия втечение 20 мин с последующим охлаждением в течение 2 ч. Время инкубации сантителами составляло 60 мин при комнатной температуре. После проведенияреакции срезы докрашивали гематоксилином.2.2.4.
Система оценки экспрессии иммуногистохимических маркеровПоложительная реакция на ММП проявлялась в виде коричневогоокрашиванияцитоплазмыкератиноцитов/опухолевыхклетокразличнойинтенсивности. Оценка интенсивности экспрессии ММП оценивалась как“слабая”, “умеренная” или “сильная”:•Слабая (+) – менее 10% слабо окрашенных клеток•Умеренная (++) – 10-30% умеренно окрашенных клеток•Сильная (+++) – более 30% интенсивно окрашенных клеток35.2.2.5. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопияДляполучениясканирующийснимковмикроскописпользовалсяVivaScope1500,конфокальныйLucidInc,лазерныйосуществляющийсканирование на длине волны 830 нм с оптической мощностью не более 16 мВт.Процедура являлась безболезненной для пациента, продолжалась в течение 10-15минут.
Небольшое количество иммерсионного масла наносилось на исследуемыйучасток кожи пациента, затем стекло из полимерного материала (для каждогопациента индивидуальное), соединенное с металлическим кольцом при помощиадгезивной ленты во избежание смещения во время исследования, размещалосьна обработанной маслом области кожного покрова. Далее, на поверхностьфиксированного на коже стекла наносилась иммерсионная жидкость (гель наводной основе), после чего к металлическому кольцу при помощи магнитаприсоединялась линза КЛСМ и проводилась процедура сканирования кожи.В результате сканирования были получены снимки размером 8х8 мм, сразмером кадра 0.5х0.5 мм. Для всех исследуемых областей было получено 4мозаичных снимка (Viva Block) на уровнях рогового, зернистого/ шиповатогослоев, на уровне дермо-эпидермального сочленения, а также поверхностнойдермы. Также у каждого пациента, которому проводилось исследование методомКЛСМ, получено дерматоскопическое изображение изучаемого участка кожногопокрова.
Кроме того, проведено видео-документирование ряда исследуемыхобластей с целью визуализации кровотока в расширенных сосудах дермы.2.2.6. Система оценки снимков, полученных методом КЛСМДля оценки степени фотостарения кожиисследовали следующиепараметры снимков, полученных методом КЛСМ: толщина эпидермиса, характергеометрии борозд кожи, наличие атипичной структуры “медовых сот”, пестройпигментации, полициклических контуров сосочков дермы, а также структурадермального слоя кожи, представленные в Таблице 2 [87, 201].36.Таблица 2 - Система оценки признаков фотоповреждения кожи методомКЛСМПризнак, выявляемыйметодом КЛСМОписание признакаИзмеряется в микронах (от первогопоявления признака “медовых сот”до появления верхних структурколлагена)Характер бороздБорозды – темные линии междугруппамикератиноцитов;характеризуются по характеру ихориентации и пересечения междусобойиописываютсякак“ромбоидальный” или “линеарный”тип в зависимости от преобладаниятого или иного паттернаАтипичная структура Визуализируетсяввиде“медовых сот”полигональныхкератиноцитовразличных формы и размера,границыклетокневсегдаопределяются в пределах даннойструктуры.Оцениваласьпоплощади, занимаемой в зонеисследуемой области (0%/<10%/ 1050%, >50%)Крапчатая пигментация Наличиекластеровсветлыхкератиноцитов в составе структуры“медовых сот” Оценивалась поплощади, занимаемой в зонеисследуемой области (0%/<10%/>10%)ПолициклическиеБулавовидные проекции и тяжи,контуры сосочковиногда анастомозирующие междусобойсосложнымизвитымрасположением.Оцениваласьплощадь, занимаемая в зонеисследуемой области (0%/<10%/>10%)Коллаген дермы:Выделяют 4 типа коллагена поданнымКЛСМ.Оцениваласьплощадь,занимаемаяопределеннымпаттерномвисследуемой области( нет/менее 25%;>25%)ТонкийСветлыетонкиеволокнистыеретикулярныйструктуры, формирующие тонкийколлагенпаутинообразный паттерн.
ЭтиГистопатологическаякорреляцияТолщина эпидермиса37--Различная степеньдискератозаПигментированныекератиноциты всупрабазальных слояхэпидермисаАнастомзирующие междусобой эпидермальныегребниТонкие коллагеновыеволокна.Грубые структурыколлагенаБесструктурныйколлагенИзвитые светлыеструктурыНаличие чешуекГиперкератозструктуры особенно очевидны взоневокругфолликулярныхотверстийГрубые волокнистые структуры сКрупные пучкитенденциейкгруппировке.коллагеновых волоконСетчатыйпаттернвсеещеопределяется, но с более крупнымии имеющими различную формупространствами между волокнамиКрупныесветлыескопления Базофильная дегенерацияаморфного материала, отдельныеколлагенаволокнистыеструктурынеопределяютсяСветлые толстые короткие волокна,Фрагментированныеиногда формирующие компактныеэластические волокнамассыАморфный материал с различнойотражающейспособностью(нет/есть)Толщина рогового слоя более 15ГипекератозмкмКорнеоциты, визуализирующиесяИндивидуальныекак отдельные единичные клетки в корнеоциты, не связанные сроговом слое (нет/есть)роговым слоемРезко очерченные клетки с тонкимПаракератозярким контуром, окружающимтемное ядро в роговом слое(нет/есть)ПолнаяутратанормальнойДисплазия эпидермисаархитектоникишиповатогоизернистогослоевэпидермиса(нет/есть)Резко очерченные светлые клетки Экзоцитоз (воспалительныйнебольшого размера, овальной илиинфильтрат)округлой формы (нет/есть)НаличиеиндивидуальныхкорнеоцитовНаличиеполигональных клеток,содержащих ядра, вроговом слоеПолная дезорганизациякератиноцитовсутратойпаттерна“медовых сот”Наличиеокруглыхклеткок, содержащихядра, в шиповатом/зернистом слояхНаличиесветлых Крупные светлые клетки с плохоклеток в дермеопределяемымивизуальнограницами (нет/есть)Наличие расширенных Сосуды,расположенныесосудовпараллельно плоскости снимка, впросвете визуализируется движениеформенныхэлементовкрови(нет/есть)МеланофагиРасширение сосудистойсетиТолщина эпидермиса рассчитывалась в микронах, характер геометрииборозд кожи определялся по принципу преобладающего паттерна (ромбовидныйили линеарный).
Такие признаки, как наличие крапчатой пигментации,38.полициклических контуров сосочков дермы, а также структура коллагеновых иэластических волокон дермы оценивался по принципу: отсутствие, наличие менее10%, наличие более 10%. Признак атипичной структуры “медовых сот” былоценен с использованием следующей градации: отсутствие, наличие менее 10%,от 10 до 50%, более 50%.Для характеристики очагов АК дополнительно использовались такиепризнаки, как наличие чешуек, индивидуальных корнеоцитов, полигональныхклеток, содержащих ядра, в роговом слое эпидермиса, наличие округлых клеток,содержащих ядра, и дендритических клеток в шиповатом/ зернистом слояхэпидермиса, полная утрата структуры “медовых сот”, наличие светлых клеток исосудов, расположенных параллельно снимку, в дерме.
В отношении данныхпараметров оценка проводилась по принципу определения наличия илиотсутствия искомого признака.2.2.7. Морфологический метод исследованияМатериал фиксировали в 10%-ном растворе формалина, забуфференном поЛилли при рН-7,4, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийныесрезы толщиной 3-5 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затемокрашивали гематоксилином и эозином.2.2.8. Система оценки патоморфологических признаков актиническогокератоза при гистологическом исследованииОценивалиськератоза, кактакиепатоморфологическмекритерииактиническогогиперкератоз, паракератоз, степень диспластических измененийэпидермиса, явления эластоза, наличие лимфоцитарного инфильтрата в дерме.2.2.9.
Статистический методСтатистическийанализданныхпроводилсясиспользованиемстатистического непараметрического критерия - точного метода Фишера, независящегоотхарактерараспределенияпоказателя.Этоткритерийнепосредственно применим для сравнения дискретных переменных, причемточный метод Фишера можно применять даже в тех случаях, когда значениепризнака встречается очень редко (вплоть до нуля раз).39.Для каждого признака (из числа включенных в анализ) проводилосьпопарное сравнение заданных групп пациентов (реализаций), выявлялисьдостоверные различия.
Вычислялся также относительный риск каждой градациифакторов риска (признаков) с доверительным 95% интервалом.Для формирования графиков, а также для проверки нормальностираспределения количественных признаков, получения описательной статистики ипроведения сравнения сформированных групп пациентов использованы пакетыпрограмм EXCEL 2010 и STATISTICA 6.0.40.ГЛАВА 3.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИСЛЕДОВАНИЙ3.1.Клиническаяхарактеристикапациентов,включенныхвисследованиеВ исследование было включено 122 пациента, разделенные на 5 групп взависимостиотвозрастаиналичияпредраковыхизлокачественныхэпителиальных опухолей кожи (актинический кератоз, базально-клеточный раккожи):•менее 34 лет•35-49 лет•50-64 года•более 65 лет•пациенты с АК и БКР (более 60 лет)Всего в исследовании принимали участие 92 (75,4%) женщины и 30 (24,6%)мужчин.
Характеристика пациентов по полу, возрасту и фототипу кожипредставлена в Таблице 3.Таблица 3 - Характеристика пациентов, включенных в исследованиеклинических признаков выраженности дерматогелиоза по модифицированнойшкале SCINEXAГруппа 1< 34 летГруппа 235-49 летГруппа 350-64 годаГруппа 4 >65 лет151521213 (20%)12 (80%)6 (40%)9 (60%)4 (19%)17 (81%)2 (9,5%)19 (90,5%)28,5 ± 1,244,5±1,258,0±0,9472,2±1,272,2±1,12 (13.3%)0 (0%)2 (9,5%)3 (14,3%)17 (34%) 24 (19,7%)II12 (80%)13 (86,7%)18 (85,7%)16 (76,2%)30 (60%)89 (73%)III1 (6,7%)2 (13,3%)1 (4,8%)2 (9,5%)3 (6%)9 (7,4%)ЧислопациентовПолМужчиныЖенщиныСреднийвозрастФототипI41Группа5(с АК,БКР)50Всего12215 (30%) 30 (24,6%)35 (70%) 92 (75,4%).Подавляющая часть пациентов принадлежала к II фототипу кожи – 89человек (73%), 24 (19,7%) человека имели I фототип и 9 (7,4%) - III фототип кожипо Глогау.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
