Диссертация (1140808), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Все факторы роста, иБоТП в том числе, считаются элементом перспективной биотехнологии,рентабельность которой ранее подтверждена, и дальнейшее развитие которойсовершенно очевидно. Для точного понимания этой технологии и правильногоеё использование на благо пациентов, требуется выполнение последующихразработок. Подобные изучения могут помочь открыть факультативныепривилегии применения указанного способа для заживления ран ирегенерации тканей в различных областях медицины.37В изученном научном материале нами не обнаружено данных обиспользованииразмельченногоаутохрящасаутоплазмойвоториноларингологии и в частности в ринохирургии. В тоже время, мыпредпринялипопыткунайтирезультативныйметодпредотвращенияосложнений после таких часто встречающихся вмешательств как различныеварианты септопластики. На наш взгляд аутохрящ и аутоплазма с еёуникальными свойствами представляются наиболее перспективными.
Намипредприняты следующие этапы: морфологические, экспериментальные иклинические методы исследования и их сравнительный анализ.38Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ2.1 Морфологические методы исследования in vitro.Начальной стадией данного проекта было проведение исследования,цель которого – морфофункциональное изучение in vitro хондроцитовхрящевых микрографтов, погруженных в белково-тромбоцитарный сгусток.В лаборатории клеточных технологий Института Биофизики АН Россиивыполнен данный фрагмент работы. Использовались в работе образцыдеформированных фрагментов четырехугольного хряща, взятые во времявыполнения операции септопластики.Извлеченныефрагментычетырехугольногохрящатщательноразмельчали, соединяли с белково-тромбоцитарным сгустком и помещали напитательные среды в термостат.
Спустя 3 суток проводили гистологическиеисследования материала (окраска гематоксилин-эозином, увеличение х100 их200).Проведенныеэкспериментыпозволилисделатьвывод,чтосодержащиеся в аутобелке крови хрящевые фрагменты, размером непревышающие 0,5 мм3 и дислоцированные на чашки с питательной средой(рис.1), свою жизнеспособность сохраняют (рис. 2).абРис. 1. Культивирование invitro хондроцитов в аутобелкеа. – размещенные на чашках с питательной средой микрографты аутохряща, окутанныеаутобелком;б.
– хондроциты в толще белка из хондробластов39абРис. 2. Микроскопическая картина хрящевых фрагментов в аутобелкеа. обрывки надхрящницы и хрящевые графты в белково-тромбоцитарной оболочке(увеличение х 100);б. хрящевые графты в аутобелке (увеличение х 200)Выполненные эксперименты продемонстрировали, что полимеризацияпротеинов плазмы влечет за собою проникновение в сгусток из данной порцииплазмы всех тромбоцитов. Следовательно, выделение слоев плазмы иполучение БоТП по специальным технологиям совершенно неважно.Содержание тромбоцитов в протеиновом сгустке неизменно останется выше,чем в другой части БоТП.
Результат формирования хондроцитов изхондробластов, содержащихся в хрящевых микрографтах, объединенных впротеиновый сгусток становится очевидным и объяснимым. Погруженные вбелковую оболочку хрящевые фрагменты, вероятно, сохраняют своюжизнеспособность за счет получения питательных субстанций путемодносторонней диффузии из прилегающих питательных сред и своих запасовпитательных веществ.402.2 Морфологические и экспериментальные методы исследованияin vivo.Следующей стадией данного проекта было исследование in vivo,проведенное в Институте Медико-биологических исследований и технологийАНО «ИМБИИТ».Цель исследования – познание свойств и взаимодействия богатойтромбоцитами плазмы с хрящом в эксперименте на животных.Для исследования использовались образцы хряща, взятые из уха крыс,не участвующих в эксперименте.С цель получения богатой тромбоцитами плазмы крови у крыс, вдальнейшем не участвующих в эксперименте, в пластиковую пробирку сантикоагулянтом (3,8% раствор цитрата натрия) набирали кровь всоотношении 1:9, затем, центрифугировали при 1200 об./мин (около 300g) втечение 5 минут и собирали супернатант.Из уха интактной крысы забирали хрящ.
Извлеченный хрящ погружалив богатую тромбоцитами плазму на несколько минут с добавлением 10%раствораCaCl(4сформировавшимисякаплирастворасгусткамиина1млплазмы),имплантировалиобертывалиживотнымподнадкостницу в теменно-затылочную область.Животные. Вид: крысы, линия: нелинейныеИсточник: питомник лабораторных животных ФГУП ОПХ «Манихино».Возраст животных - 3 мес., вес тела: 170 – 230 г., количество: 9 голов.Содержание животных.
Крысы содержались в стандартных условиях,соответствующих Санитарным правилам по оборудованию, устройству исоставу экспериментально-биологических клиник (вивариев). Животныхсодержали группами (по 9 голов) в поликарбонатных клетках. Употреблялиопилки лиственных пород в качестве подстила.41Крысы получали стандартный гранулированный корм для лабораторныхгрызунов ПК 120-899. Микробиологический состав пищи соответствует ГОСТР 51849-2001 «Ветеринарно-санитарные нормы и требования к качествукормов для непродуктивных животных» и отрицательного воздействия наитоги выполненного эксперимента не оказывает.Формирование групп. Крысы расформированы на 2 отряда случайнымобразом. Имплантацию производили с двух сторон: в левую сторонуимплантировали чистый хрящ, в правую – хрящ, выдержанный в плазме.Таким образом распределились и группы крыс: группа L- животные, которымимплантировали хрящ; группа R- животные, которым имплантировали хрящ сбогатой тромбоцитами плазмой.Подготовка к имплантации.
Животных не кормили за сутки до началапроведения исследования. Перед имплантацией крысам проводили общуюанестезию с помощью внутримышечных инъекций ветеринарного препаратаЗолетил (производство Франция, рег. № ПВИ-2-1.9/01425) в дозе 15 мг/кг.Выбривали шерсть в области лобной кости.Проведение имплантации.
Обрабатывали 70% раствором спирта местоимплантации. С помощью одноразовых скальпелей производили 2 разреза вобласти лобной кости в асептических условиях. С левой стороны помещалиподнадкостнично нативный хрящ, с правой – обработанный богатойтромбоцитамиплазмой.РассасывающимсяшовнымматериаломMONOCRYL*Plus (фирмы «Eticon») ушивали раны.Наблюдение за животными.
Вели мониторинг за всеми грызунами напротяжении всего исследования. Фиксировали и отмечали следующиепараметры: общий вид (шерстный покров, конечности, зубы, глаза, уши);поведение и состояние (питание, активность, темперамент, походка);физиологические функции (мочеиспускание, экскрет, слюноотделение,42дыхание), заживление ран (тип заживления, сроки заживления, наличиеинфекции, некротических тканей, гематом).Терминальные процедуры. Крыс подвергали эвтаназии методомдекапитации с последующим обескровливанием.
Сразу после гибелипроводили забор из зоны имплантации материала для гистологическихисследований.Гистологические исследования. Извлеченные после эвтаназии образцыткани обрабатывали следующим образом: закрепляли в 10% растворенейтрального формалина, по общепринятой методике заливали в парафин,изготовляли серийные срезы толщиной 5 мкм, окрашивали по методуМаллори и гематоксилин-эозином.Регулирующие стандарты.требованиямпротоколаИсследовательская организация следовалаисследованияистандартнымоперационнымпроцедурам (СОП) лаборатории.Исследование выполнялось в соответствии с ГОСТ 10993.6 – 2009 и стребованиями Правил лабораторной практики в Российской Федерации(Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РоссийскойФедерации № 708н от 23.08.2010).Все манипуляции с животными были рассмотрены и утвержденыкомиссией института и проведены в соответствии с Международнымирекомендациями, согласно правилам гуманного обращения с животными, атакже с соблюдением требований и биоэтических норм Международногокомитетапонауке.Аудировалавыполнениеисследованияслужбаобеспечения качества исследовательской организации.Все исходные данные, документация, копии протоколов, имеющиеотношение к этому исследованию, хранятся в архиве АНО «ИМБИИТ».43Документы:1.ГОСТ Р ИСО 10993.6-09 «Изделия медицинские.
Оценкабиологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследованиеместного действия после имплантации».2.Санитарные правила № 1045-73 по устройству, оборудованию исодержанию экспериментально-биологических клиник.3.Международныерекомендациипопроведениюмедико-биологических исследований с использованием животных // Ланиматология. –1993. - №1 – С.294.Правило лабораторной практики в Российской Федерации (ПриказМинистерства здравоохранения Российской Федерации №267 от 19.06.2003).5.ТребованияМеждународногокомитетапонаукепоиспользованию в экспериментальных исследованиях лабораторных животных// Бюллетень ИКЛАС. – 1978.
- № 24. – С. 4-5.Изстандартизированныхпоилокподавалиотфильтрованнуюводопроводную воду. Микробиологический статус воды соответствуетСанПиН 2.1.4.1074-01«Гигиеническиетребованияккачеству водыцентрализованных систем питьевого водоснабжения» и на исход данногоэксперимента не производит отрицательного воздействия.Условия окружающей среды содержания лабораторных животных:Температура: +18 +22°C, Влажность: 50-65%, Освещение: 12 часовойцикл, Воздухообмен: 10 раз в час замена объема воздуха.Акклиматизация. За две недели до начала эксперимента животные былиадаптированы (акклиматизированы) в лаборатории.Осмотр внешнегосостояния животных осуществлялся ежедневно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
