Диссертация (1140039), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Далее методом калориметрии определяли плотностьокраски раствора, по которой вычисляли концентрацию вещества, то есть pro ANP.Процедуру анализа выполняли в соответствии с инструкциями к набору.II.3.2 Исследование cGMP (вторичного мессенджера ANP) в моче больныхХГН.У больных ХГН исследовали уровеньэкскреции с мочой сGMP методомиммуноферментного анализа: 10 мл утренней мочи собирали в сухие пластиковыепробирки и центрифугировали (при 1500 об/мин) в течение 5 минут при комнатной38температуре для удаления клеток мочевого осадка, затем забирали надосадочныйслой мочи, который до проведения исследования замораживали при температуре 20С. Результат концентрации cGMP выражали в пмоль/мл.Использовалинабор (Assay Designs' Correlate-EIA™ cyclic GMP, США)кроличьих поликлональных антитела к сGMP для конкурентного связывания сGMP.После инкубации при комнатной температуре избытки реагентов удаляли припромывке и добавляли субстрат.
После короткой инкубации энзиматическуюреакцию останавливали и развившееся желтое окрашивание измеряли с помощьюмикропланшетного ридеражелтойокраскибыладлиной волны 405 нм. Интенсивность развившейсяобратнопропорциональнаколичествусGMP,присутствующего в образцах или стандартах. Для расчета концентрации сGMPиспользовали показания оптической плотности (ОП). Применяли стандарт cGMPStandard – вариант без ацилирования (реакция присоединения ацильной группыкарбоновой кислоты, повышает чувствительность метода).Перед тем как добавить поликлональные антитела к раствору стандарта cGMPон подвергался разведению по определенной методике. Было пронумеровано шестьстеклянных пробирок 12 x 75 мм с №1 по №6.
В пробирку №1 вносили 900 мклбуфера для разведения стандарта (рабочий буфер 2 или культуральная среда) и 800мкл соответствующего раствора для разведения стандарта в пробирки №2-6, затем впробирку №1 вносили 100 мкл - 5000 пмоль/мл стандарта, затем содержимоетщательно перемешали на вортексе (прибор для интенсивного перемешивания). Изпробирки №1 переносили в пробирку №2 200 мкл раствора и снова тщательноперемешали на вортексе. Такую процедуру повторяли в пробирках №3 - №6. В39результате получили серию стандартных разведений с концентрациями 500, 100, 20,4, 0.8 и 0.16 пмоль/мл, соответственно.Буфер для промывок приготовляли путем разведения 5 мл поставляемого внаборе концентрата буфера в 95 мл деионизированной воды.Все реагенты оставляли в пробирках при комнатной температуре в течение неменее 30 минут, причем образцы и стандарты дублировали на случай ошибок.Концентрацию cGMP в образцах рассчитали следующим образом:1.
Сначала опредилили «среднюю чистую оптическую плотность связывания» длякаждого стандарта и образца вычитанием среднего значения «оптической плотностинеспецифического связывания» из среднего значения «оптической плотностисвязывания», то есть, средняя «чистая ОП» = среднее значение «ОП связывания» среднее значение «ОП неспецифического связывания».2. Затем рассчитывали связывание для каждой пары (дублей) стандартов как процентот максимального связывания. При этом использовали следующую формулу: %связывания = «чистая ОП» x 100 / «чистая ОП».403. При помощисвязывания»графической бумаги (Logit-Log) отмечали точки «процентапротивконцентрацийcGMPвстандартахспостроениемкалибровочной кривой.Концентрацию cGMP в исследуемых образцах определили интерполяцией наточки калибровочной кривой, при этом полученная линия имела уклон 1.060 икоэффициент корреляции 0.998.Параметры используемого набора определяли в соответствии с указаниямиперечисленными в протоколе оценки Национального Комитета по КлиническимЛабораторным Стандартам (NCCLS).Чувствительность метода была рассчитана на основании сравнения среднейоптической плотности шестнадцати (16) повторов максимального связывания сосредней оптической плотностью шестнадцати (16) повторов стандарта № 6.
ПределчувствительностиметодаравенконцентрациичеловеческогоcGMP,соответствовавшей двум стандартным отклонениям от нуля по калибровочнойкривой.Воспроизводимостьметодавнутрисериирассчиталимногократнымтестированием (n=16) образцов с низкой, средней и высокой концентрацией cGMP водной постановке.II.4. Методы статистической обработки полученных результатовДля статистического анализа полученных данных был использован пакетприкладных программ STATISTICA 6,0 и SPSS 11.5. На основании критериевШапиро-Вилка и χ2 Пирсона было оценено нормальное распределение исследуемыхпоказателей. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение,использовали критерий Манна-Уитни или критерий Крускалла-Уоллиса.
Определялимедиану,разбросвеличинпоотношениюкмедианепопоказателюинтерквартильного размаха (25%, 75% процентили). В тексте работы все значения41представлены в виде медианы, в фигурных скобках указан интерквартильныйразмах.Корреляционныйанализ проводилиметодом ранговойкорреляцииСпирмена. Критический уровень значимости для всех статистических данныхпринимали равным 0,05.42ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯIII.1. Определение уровня pro ANP в плазме крови больных ХГНОценка уровня pro ANP в плазме крови больных ХГН и здоровыхдобровольцев показала, что у больных ХГН в среднем он был выше (3,09 {2,08-5,32}нмоль/л), чем у здоровых людей (2,67 {1,95-3,24} нмоль/л), однако разница недостигластатистическойзначимости(р>0,05)из-забольшогоразбросаиндивидуальных показателей среди больных ХГН (табл 1,рис 1).Таблица.1.
Уровень pro ANP в плазме крови больных ХГН и контрольнойгруппыГруппыУровеньproANP,Достоверностьнмоль/лБольные ХГН3,09 {2,08-5,32}р>0,05(гр I,II,III,IV), n-60Контрольная(здоровые), n-9группа2,67 {1,95-3,24}43Рисунок 1. Уровень pro ANP в плазме крови больных ХГН и здоровых людей(контроль)Больные ХГНКонтрольнаягруппаПлазменный показатель proANP зависел от клинической активности ХГН: у больныхпротеинурическими формами в целом (группы I,II,III) он был достоверно выше, чему больных вне обострения (группа IV), соответственно 4 {2,56-6,49} и 2,04 {1,512,97} нмоль/л, р˂0,05 (табл 2, рис 2).Таблица.
2. Зависимость уровня pro ANP от активности ХГНБольные ХГНУровень pro ANP, Достоверностьнмоль/лПротеинурическиеформы 4 {2,56-6,49}(группы I,II,III) (n-49)Р I,II,III-IV˂0,05Неактивный ГН (гр IV) (N-11)2,04 {1,51-2,97}Контроль (n-9)2,67 {1,95-3,24}рК-IV>0,05pК-I,II,III˂0,0544Рисунок 2. Зависимость уровня pro ANP в плазме крови от активности ХГНАнализ уровня pro ANP отдельно среди больных протеинурическими формамиХГН выявил зависимость степени повышения уровня pro ANP в плазме крови отклинической активности ХГН - выраженности ПУ, белковых сдвигов крови и/илиналичия ПН. У больных с умеренным МС (группа III) имелась лишь незначительнаятенденция к повышению pro ANP по сравнению со здоровыми людьми и больными снеактивный ГН.
У больных с НС (группы I,II), то есть с наиболее клиническиактивными формами нефрита, средний уровень pro ANP был достоверно выше, чему здоровых лиц и больных групп III,IV (табл 3,рис 3).45Таблица.3. Уровень pro ANP в плазме крови больных разными клиническимиформами ХГНГруппы больных ХГНПоказательДостоверностьn=60Протеинурические формыХГНPro ANP, нмоль/лРГруппа I - НС с ПН7,08 {4,28-8,67}р I-к˂0,05р I-II˂0,05n=18р I - III˂0,05p I-IV˂0,05Группа II - с НС без ПН (n=16)3,86 {1,91-4,81}р II-к˂0,05p II-IV˂0,05Группа III - с умеренным МС2,93 {1,94-5,3}р III-к >0,052,04 {1,51-2,97}р IV-к˃0,05n=15Группа IV-с неактивным ГНn=11Контрольная группа здоровых 2,67 {1,75-3,25}pK-I˂0,05людей (К)pK-II˂0,05n=9Результаты представлены в виде медианы, в скобках указаны 25 и 75процентили46Рисунок 3.
Уровень pro ANP в плазме крови больных различнымиPro ANP (нмоль/л)клиническими формами ХГНСтрелками отмечены достоверные различия между группами (р˂0,05)Особенно высоким этот показатель оказался в группе больных с НС и ПН(7,08 {4,28-8,67} нмоль/л). Именно среди больных с НС и ПН выявлены самыевысокие в нашем наблюдении индивидуальные показатели pro ANP, достигающиеуровня 9,64 нмоль/л, что отразилось на наиболее высоком в нашем исследованиисреднем показателе плазменного pro ANP в этой группе больных (табл 4).47Таблица 4.
Уровень pro ANP в плазме крови больных ХГН с НС без и с ПН.Группы больныхУровеньвкровиProплазме ДостоверностьANP,нмоль/лГруппа I с НСи ПН 7,08 {4,28-8,67}рI-II˂0,05(n=18)Группа II с НС без ПН 3,86 {1,91-4,81}(n=16)Среди больных ХГН (группы I-IV) установлена сильная обратная корреляциямежду уровнем в плазме крови рro ANP и уровнем в сыворотке альбумина (Rs= 0,46; р˂0,01) и прямая корреляция между плазменным уровнем pro ANP и величинойсуточной ПУ (Rs=0,49; р˂0,001), сывороточным уровнемкреатинина (Rs=0,28;p<0,05) (рис 4,5,6).Рисунок 4. Уровень pro ANP в плазме крови больных ХГН (группы I-IV) вальбумин, г/лзависимости от показателя альбумина в сыворотке крови (Rs= -0,46; р˂0,01).504540353025201510500246pro-ANP, нмоль/л8101248Рисунок 5. Уровень pro ANP в плазме крови больных ХГН (группы I-IV) взависимости от показателя суточной ПУ (Rs=0,49; р˂0,001).1412СПУ, г/л1086420024681012pro-ANP, нмоль/лРисунок 6.