Диссертация (1139990), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Принцип метода основан на сорбировании в лунках планшета моноклональных антител, специфичных к цитокинам. Интерлейкины 4, 5 и 13, присутствующие в образцах, связываются с антителами в лунках планшета. Добавляемый конъюгат биотина с антителами к соответствующим цитокинам связываетих. Добавляемый в лунки конъюгат стрептавидин-HRP связывается с биотином,конъюгированным с цитокинами. После инкубации и промывки из лунок удаля-47ются несвязавшиеся конъюгат биотина с антителами к цитокинам и стрептавидиновый конъюгат, и в лунки плюсовался субстратный раствор, который взаимодействуя с ферментным комплексом образует окрашенный раствор. Реакция останавливается добавлением кислого стоп-раствора.
Интенсивность окраски, измеренная при длине волны 450 нм, оказывается прямо пропорциональной концентрации ИЛ-4, -5 и -13, присутствующих в образцах. Концентрация исследуемыхцитокинов в образцах определяется по стандартной кривой, построенной по семиприготовленным разведениям стандарта.2.2.3 Определение циркулирующих иммунных комплексовДля определения ЦИК в сыворотке крови использовали набор реагентов«БиоХимМак» и спектрофотометр СФ-101 (Россия, 2004 г.).
Метод заключался вреакции преципитации полиэтиленгликолем 6000 определенной концентрации, затем сравнивались величины светопропускания опытного (сыворотка в среде полиэтиленгликоля) и контрольного (сыворотка в среде без этиленгликоля) образцов.Содержимого пробирок измеряли в спектрофотометре при длине волны 405 нм.2.2.4 Определение эндотелина-1Идентификацию ЭЛ-1 проводили тест-системами фирм «BIOMEDICAGROUP» (Германия). Другой тип моноклональных антител уже был представленв виде комплекса независимого эпитопа молекул цитокина с биотином. Конъюгатпероксидазы хрена со стрептавидином – это индикаторный компонент, которыехорошо взаимодействует с биотином.
В результате многочисленных промывок иинкубаций в ячейки вносят индикатор и исследуемый субстрат. Далее на длиневолны 450 нм с помощью автоматического иммуноферментного анализатора измеряли активность связанной пероксидазы хрена.482.2.5 Статистическая обработка материалаДля статистического анализа использовались пакеты программ Statistica 7.0,StatSoftInc.; Excel Microsoft Office профессиональный плюс 2010. Определениераспределения признаков производилась методом Колмогорова – Смирнова с учетом показателей эксцесса и симметричности. Для описательной статистики использовали медиану и квартильный размах Me (25%; 75%) в случае количественных признаков. Мода и ее частота (Mod (%)) или относительная частота (%) использована для оценки качественных признаков.Проверку статистических гипотез проводили с использованием U-критерияМанна – Уитни для количественных переменных, и Хи-квадрат для качественных.В динамике изучали проводили ранговый дисперсионный анализ по Фридмену,вычисляли коэффициент конкордации Кендалла.
Однофакторный непараметрический дисперсионный анализ проводили в несвязанных выборках, анализировалиранговую корреляцию по Спирмену. Далее осуществляли сравнение частот бинарного признака (в двух несвязанных группах) с расчетом относительного рискаи его доверительного интервала (L и U, соответственно, нижняя и верхняя границы). Критический уровень значимости (α) был принят равным 0,05.493.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1 Роль эндотелина-1 (фмоль/мл) у пациентов с атопическим дерматитомВ настоящее время в литературе имеются только единичные данные о ролиЭЛ-1 в патогенезе АтД. Известно, что ЭЛ-1 – это мощный вазоконстриктор, аважным клиническим симптомом при данном заболевании является белый дермографизм.
Выяснено, что данный показатель повышается в период обострения АтДи меняется в зависимости от распространенности патологического процесса накоже и возраста пациента [69]. Однако до настоящего времени в доступной намлитературе нет данных о изменении данного показателя в зависимости клинических форм АтД, показателей индекса SCORAD и выраженности субъективныхощущений. Именно поэтому нас и заинтересовало изучение данного вопроса.Исследование ЭЛ-1 мы провели у 17 здоровых детей и 121 ребенка, страдающего АтД. При статистической обработке материала мы наблюдали резкое увеличение данного показателя у пациентов до 2,1 ± 0,91 фмоль/мл (р < 0,001) посравнению с группой контроля (0,49 ± 1,1 фмоль/мл) (рисунок 1, таблица 6). Величина ЭЛ-1 была неодинаковой и зависела от клинической формы дерматоза, величины индекса SCORAD и интенсивности зуда (таблица 6).2,521,510,50Здоровые детиПациенты с атопическимдерматитомРисунок 1 – Показатель ЭЛ-1 у здоровых детей и больных АтД, фмоль/мл50Таблица 6 – Содержание ЭЛ-1 у детей, больных АтД, в зависимостиот клинической формы дерматоза, величин индекса SCORADи интенсивности зуда, фмоль/мл (M ± m)Группы пациентовnЭЛ-1, фмоль/млP*Р**Здоровые дети170,49 ± 1,1Пациенты с АтД, в том1212,1 ± 0,91< 0,001числе:со значением ин201,7 ± 0,8< 0,001< 0,05декса SCORAD 1–3940–59841,9 ± 0,3< 0,001< 0,0560–103172,2 ± 1,2< 0,001< 0,001с тяжелым зудом382,3 ± 1,1< 0,001< 0,05с зудом средней632,0 ± 0,84< 0,001< 0,05тяжестис легким зудом201,45 ± 1,78< 0,001< 0,05экссудативной172,14 ± 1,5< 0,001< 0,001формойэкссудативно692,11 ± 0,95< 0,001< 0,001сквамознойэкссудативно251,91 ± 1,71< 0,001< 0,05сквамозной с явлениями лихенизациилихеноидной51,72 ± 1,87< 0,001< 0,05пруригоподобной51,6 ± 1,36< 0,001< 0,05Примечание: р* – достоверность различий между здоровыми лицами и группойбольных; р** – достоверность различий между группами пациентов с АтД.У детей с экссудативной и экссудативно-сквамозной клиническими формами АтД нами получено повышенное содержание ЭЛ-1 в периферическойкрови, которое составляло 2,14 ± 1,5 и 2,11 ± 0,95 фмоль/мл.
При экссудативно-сквамозной с явлениями экзематизации, лихеноидной и пруригоподобнойформами дерматоза данный показатель значительно превышал результатгруппы контроля (р < 0,001), однако достоверных различий от цифр общейгруппы наблюдаемых мы не получили (p < 0,05). Между клинической формойАтД и содержанием ЭЛ-1 нами прослежена прямая корреляция (r = +0,41,51р < 0,05). Таким образом, при более выраженных признаках экссудации в клинической картине дерматоза показатель ЭЛ-1 увеличивался. Нами выявленаопределенная взаимосвязь величины ЭЛ-1 и индекса SCORAD.
При значениииндекса SCORAD 60–103 данный показатель был максимальным. Более того,в сравнении с результатом в группе контроля анализируемый показатель былувеличенв 1,5 раза (у лиц с абсолютными величинами SCORAD 1–59) в сравнении создоровыми детьми. При этом зарегистрированная в данной группе величинаоказалась ниже абсолютного значения этого показателя в целом у больныхАтД. Показатель ЭЛ-1 при значительной интенсивности зуда был значимоувеличен в сравнении со значениями показателей, полученных как у наблюдаемых пациентов, так и в группе контроля (p < 0,001).РезюмеВ результате проведенных исследований нами установлено, что величинаЭЛ-1 в периферической крови пациентов находится в прямой зависимости отклинической формы дерматоза, значения индекса SCORAD и интенсивности зуда.3.2 Роль нарушения секреции цитокинов у пациентов с атопическим дерматитомИсследование цитокинового профиля проводилось у 17 здоровых детей и121 пациента с АтД путем определения в сыворотке крови ИЛ-4, -5 и -13.Анализ результатов исследований ИЛ-4 выявил у здоровых детей колебанияв пределах 1,82 ± 0,67 пг/мл, а у пациентов с АтД – в среднем составили 1,87 ±0,75 пг/мл (р ≥ 0,05) и не зависел от клинических форм заболевания, распространенности патологического процесса на коже, индекса SCORAD и интенсивностизуда (таблица 7).52Таблица 7 – Показатель ИЛ-4 у детей, больных АтД, в зависимостиот клинической формы, величин индекса SCORAD и интенсивности зуда, пг/мл(M ± m)Группы пациентовЗдоровые детиПациенты с АтД, в том числе:со значением индексаSCORAD 1–3940–5960–103с тяжелым зудомс зудом средней тяжестис легким зудомэкссудативной формойэкссудативно-сквамознойэкссудативно-сквамозной сявлениями лихенизацииn17121ИЛ-4, пг/мл1,82 ± 0,671,87 ± 0,75P*–≥ 0,05Р**–≥ 0,05201,85 ± 0,68≥ 0,05≥ 0,0584173863201769251,83 ± 0,711,84 ± 0,671,86 ± 0,711,85 ± 0,781,84 ± 0,691,88 ± 0,591,87 ± 0,681,86 ± 0,76≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05≥ 0,05лихеноидной51,83 ± 0,75≥ 0,05≥ 0,05пруригоподобной51,82 ± 0,78≥ 0,05≥ 0,05Примечание: р* – показатель достоверности различий между здоровыми детьми ипациентами с АтД; р** – достоверность различий между группами больных.Нами выявлены обратные корреляционные взаимосвязи между концентрацией ИЛ-4 и lgЕ в кровяном русле (соответственно r = –0,47; р < 0,001, г = –0,83; р < 0,001).
Показатель ИЛ-4 оставался в нормальных пределах при увеличении абсолютных показателей индекса SCORAD и интенсивности кожного зуда, а концентрация IgE достигала своего максимума.Показатель ИЛ-5 у группы контроля оказался равным 73,77 ± 3,4 пг/мл.Нами установлено резкое повышение концентрации ИЛ-5 у пациентов с АтД до117 ± 5,7 пг/мл (р < 0,001) (рисунок 2; таблица 8). Содержание данного показателя менялась в зависимости от клинической формы заболевания, интенсивности зуда и величины индекса SCORAD (таблица 8).53Таблица 8 – Показатель ИЛ-5 у детей, больных АтД, в зависимостиот клинической формы, величин индекса SCORAD и интенсивности зуда,пг/мл (M ± m)Группы пациентовnИЛ-5 пг/млP*Р**Здоровые дети1773,77 ± 3,4––Пациенты с АтД, в том числе:121117 ± 5,7< 0,001–со значением индекса20111,7 ± 4,3< 0,001< 0,001SCORAD 1–3940–5984114,6 ± 3,7< 0,001< 0,00160–10317120,1 ± 2,7< 0,001< 0,001с тяжелым зудом38121,6 ± 4,3< 0,001< 0,001с зудом средней тяжести63113,3 ± 2,8< 0,001< 0,05с легким зудом20110,7 ± 2,8< 0,001< 0,05экссудативной формой17116,3 ± 3,1< 0,001< 0,05экссудативно69114,6 ± 2,7< 0,001< 0,05сквамознойэкссудативно25113,8 ± 3,1< 0,001< 0,05сквамозной с явлениямилихенизациилихеноидной5110 ± 1,9< 0,001< 0,05пруригоподобной5109,8 ± 2,9< 0,001< 0,05*Примечание: р – показатель достоверности различий между здоровыми детьми ипациентами с АтД; р** – достоверность различий между группами больных.120100806040200Здоровые детиПациенты с атопическимдерматитомРисунок 2 – Показатель ИЛ-5 у здоровых детей и больных АтД, пг/млНами отмечено наибольшее повышение ИЛ-5 у пациентов с экссудативнойи экссудативно-сквамозной формами АтД по сравнению с группой контроля и в54целом группы пациентов.
Установлено также, что у пациентов с экссудативносквамозной формой, лихеноидной и пруригоподобной формами АтД концентрация ИЛ-5 была достоверно выше, чем у здоровых детей.Нами выявлена прямая зависимость концентрации ИЛ-5 со значением индексаSCORAD. Так, данный показатель был максимальным при индеке SCORAD, равным60–103. У пациентов со значением SCORAD 1–59 величина ИЛ-5 была ниже, чем вобщей группе пациентов с АтД, однако превышала показатели в группе здоровых детей. Таким образом, было выявлено, что при увеличении индекса SCORAD усиливается продукция ИЛ-5 лимфопролиферативными клетками, вследствие чего при утяжелении атопии повышается концентрация ИЛ-5 в сыворотке крови пациентов.
Концентрация ИЛ-5 у наблюдаемых нами пациентов с АтД также имела взаимосвязь свыраженностью субъективных ощущений. При тяжелом зуде наблюдалось максимальное повышение ИЛ-5 у детей, страдающих АтД, до 121,6 ± 4,3 пг/мл, что былодостоверновышесодержанияИЛ-5уздоровыхдетей(73,77 ±3,4 пг/мл; р < 0,001) и превышало значение данного показателя по сравнению с общейгруппой наблюдаемых пациентов (117 ± 5,7 пг/мл; р < 0,001).У пациентов с зудом средней степени тяжести и легким зудом нами констатировано повышение показателя, по сравнению с контрольными значениями (113,3 ± 2,8пг/мл, р < 0,001 и 110,7 ± 2,8 пг/мл, р < 0,001 соответственно), однако, был ниже результатов общей группы пациентов с АтД (117 ± 5,7 пг/мл, р < 0,05).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
