Диссертация (1139727), страница 33
Текст из файла (страница 33)
Значения pKa мелоксикама составляют 1,1 и 4,2 (амфолит с преобладанием слабокислотных свойств) [182]. Структурная формула мелоксикамабыла приведена в Таблице 3.2.1 (Глава 3).В работах по количественному определению мелоксикама в плазме кровиприведены методы жидкостной хроматографии с УФ-детектором или диодноматричным детектором, жидкостной хроматографии с тандемным массселективным детектором. В качестве способа пробоподготовки применяетсяметод осаждения белков и жидкостной экстракции [431-434]. Приведенные влитературе аналитические диапазоны данных методов позволяют считать ихпригодными для сравнительных фармакокинетических исследований препаратов мелоксикама (нПКО 10-50 нг/мл).
Нами в качестве способа пробоподготовки был выбран метод осаждения белков, как наиболее простой и производительный и метод количественного определения – ВЭЖХ-УФ. При разработкеметодики количественного определения мелоксикама в плазме крови человека220была поставлена задача достичь нПКО на уровне не более 50 нг/мл, для того,чтобы он составлял не менее 1/20 от ожидаемого значения Cmax (1000 – 2000нг/мл).Приготовление стандартных растворовДля приготовления исходного стандартного раствора мелоксикама 50 мгмелоксикама вносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 млметанола, перемешивали до полного растворения, доводили объем раствора темже растворителем до метки.
Полученный раствор имел концентрацию мелоксикама 500 мкг/мл. Для приготовления стандартного раствора мелоксикама сконцентрацией 10 мкг/мл отбирали 1 мл раствора мелоксикама с концентрацией 500 мкг/мл в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводили до метки водойочищенной. Стандартные растворы готовили путем разведения стандартногораствора с концентрацией 10 мкг/мл водой (Таблица 5.1.1).Таблица 5.1.1.Приготовление стандартных растворов мелоксикамаКонцентрация приготовленного раствора мелоксикама, мкг/мл5210,8000,6000,4000,200Количество компонента, млСтандартный раствор меВодалоксикама,С = 10 мкг/мл5 млдо 10 мл5 млдо 25 мл5 млдо 50 мл2 млдо 25 мл3 млдо 50 мл1 млдо 25 мл2 млдо 100 млПробоподготовкаК 250 мкл плазмы крови прибавляли 125 мкл 50% раствора трифторуксусной кислоты, встряхивали на вортекс-шейкере в течение 20 с, далее центрифугировали в течение 10 мин при 15200 об/мин и отделяли надосадочную жид-221кость, 200 мкл которой переносили в виалы для хроматографа с микровставками.Условия хроматографированияКоличественное определение проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1290, оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок и образцов, дегазатором, автосамплером, диодноматричнымУФ-детектором.
Обработку данных проводили при помощи программногообеспечения ChemStation (ver. А.01.04.122), Agilent Technologies, США.Подвижная фаза: 50 мМ фосфатный буферный раствор рН 3,5/ацетонитрил(55:45), предварительно профильтрованная и дегазированная на устройстве дляфильтрования под вакуумом.Скорость потока подвижной фазы: 1 мл/мин.Неподвижная фаза: хроматографическая колонка Zorbax Eclipse Plus C18150*4,6мм 5 мкм с предколонкой Zorbax Eclipse Plus C18 12,5*4,6мм 5 мкм, притемпературе 30,3 оС.Объем вводимой пробы: 10 мкл.Время хроматографирования: 7 мин.Детектирование: УФ, 364 нм ±4 нм.Время удерживания: мелоксикам – около 5,5 мин.5.1.7.2.Биоаналитическаяметодикаопределениякапецитабинаи5-фторурацила в плазме крови человекаЛитературный обзор методик анализаОдним из наиболее эффективных и современных препаратов для химиотерапии злокачественных опухолей является капецитабин. Основной химиотерапевтический эффект капецитабина, являющегося пролекарством, обусловленспособностью его основного метаболита – 5-фторурацила – ингибировать процесс деления ДНК, в результате чего, после внедрения в её структуру, образуется несовершенный фрагмент РНК, что не позволяет опухолевой клетке де-222литься и функционировать в дальнейшем.
Высокая биодоступность обуславливает широкое применение капецитабина в химиотерапии одних из наиболеераспространённых форм рака – рака прямой кишки, рака молочной железы ирака желудка как индивидуально, так и в составе комбинированной терапии.Капецитабин включён правительством РФ в Список ЖНВЛП [5], а такжев перечень стратегически значимых ЛС, производство которых должно бытьобеспечено на территории Российской Федерации [6]. В основе капецитабиналежит фторированное производное урацила, являющееся активным метаболитом препарата, поэтому существует необходимость при исследовании фармакокинетики препаратов капецитабина количественно определять как исходныйпрепарат, так и его активный метаболит в биологических жидкостях [339].Среди опубликованных методов количественного определения капецитабина и 5-фторурацила в плазме крови приведены методы жидкостной хроматографии с УФ-детектором или диодно-матричным детектором, аналитическийдиапазон методик в среднем 25-4500 нг/мл и жидкостной хроматографии смасс-селективным детектированием, предел количественного обнаружения длякапецитабина – 1,4 нг/мл, для 5-фторурацила – 8 нг/мл, с тандемным массселективным детектором (тройной квадруполь), предел количественного обнаружения для капецитабина – 4 нг/мл, для 5-фторурацила – 8 нг/мл [435-438].Приведенные в литературе аналитические диапазоны данных методов позволяют считать их пригодными для сравнительных фармакокинетических исследований препаратов капецитабина (ожидаемый диапазон концентраций капецитабина в плазме крови для исследований биоэквивалентности после однократного приема составляет около 0,1 – 5 мкг/мл, 5-фторурацила – около 10 – 500нг/мл).Приготовление стандартных растворовС учетом содержания капецитабина в субстанции капецитабина и5-фторурацила в субстанции 5-фторурацила вносили 10,1 мг и 5,1 мг субстанции капецитабина и 5-фторурацила, соответственно, что эквивалентно10 мг и 5 мг анализируемых веществ, соответственно, в мерные колбы вмести-223мостью 50 мл, прибавляли 25 мл метанола, перемешивали до полного растворения, доводили объем растворов тем же растворителем до метки.
Полученныерастворы имели концентрацию капецитабина 200 мкг/мл (раствор А) и 5фторурацила 100 мкг/мл (раствор Б). Стандартные растворы готовили путемразведения растворов А и Б метанолом (Таблицы 5.1.2 и 5.1.3).Таблица 5.1.2Приготовление стандартных растворов капецитабинаКонцентрация приготовленного раствора капецитабина, нг/мл100000,050000,020000,010000,05000,01000,0500,0200,0100,0Количество компонента, млСтандартный растворМетанолкапецитабина,С = 200 мкг/мл5,000До 10,05,000До 20,01,000До 10,01,000До 20,00,500До 20,00,250До 50,00,250До 100,00,100До 100,00,050До 100,0Таблица 5.1.3Приготовление стандартных растворов 5-фторурацилаКоличество компонента, млСтандартный растворМетанол5-фторурацила,С = 100 мкг/мл4000,02,000До 50,02000,01,000До 50,01000,00,500До 50,0400,00,400До 100,0200,00,200До 100,0Исходные стандартные растворы для проведения валидации хранили вКонцентрация приготовленного раствора 5фторурацила, нг/млморозильнике при температуре от -45°C до -50оС.
Разведения использовалисьсвежеприготовленными.224ПробоподготовкаК 200 мкл плазмы крови (либо к 180 мкл плазмы крови с прибавлением 20мкл раствора стандартного образца), помещённой в центрифужные микропробирки вместимостью 1,5 мл, прибавляли 400 мкл метанола, встряхивали нашейкере типа вортекс в течение 10 секунд, далее центрифугировали в течение15 минут при 15000 об/мин и отбирали 200 мкл надосадочной жидкости, которую переносили в виалы для хроматографа.Условия хроматографированияКоличественное определение проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе LCMS-8040, оснащенном градиентным насосом, термостатом колонок и образцов, дегазатором, автосамплером, фотодиодноматричным итандемным масс-спектрометрическим детектором.
Обработку данных проводили при помощи программного обеспечения LabSolutions (Ver. 5.3), SHIMADZUCORPORATION, Япония.Подвижная фаза: вода, 0,1 % муравьиной кислоты, 1 ммоль/л формиата аммония (А) / вода, 0,1 % муравьиной кислоты, 1 ммоль/л формиата аммония (В).Градиент подвижной фазы: 0-1 минут –0 % В; 1-1,1 минут – от 0 % до 37 % В;1,1-2,5 минут – 37 % В; 2,5-3,5 минут – от 37 % до 100 % В; 3,5-4,5 минут – 100% В; 4,5 – 4,8 минут – от 100 % до 0 % В; 4,8 – 6,5 минут – 0 % В.Скорость потока подвижной фазы: 1,2 мл/мин.Неподвижная фаза: хроматографическая колонка Zorbax Eclipse XDB-C1875*4,6 мм 3,5 мкм при температуре 37оС.Объем вводимой пробы: 10 мкл.Время хроматографирования: 6,5 минут.Детектирование:5-фторурацил – отрицательный режим ионизации, 129,15 m/z, напряжение накапилляре - 5 кВ, распыляющий газ – 2 л/мин, осушающий газ – 20 л/мин, блокнагрева - 400°С, линия десольватации – 300°С.225Капецитабин – положительный режим ионизации, 360,1→244,1, 360,1 → 130,0,напряжение на капилляре - 3,5 кВ, распыляющий газ – 2 л/мин, осушающий газ– 20 л/мин, блок нагрева - 400°С, линия десольватации – 300°С.Время удерживания 5-фторурацила: около 0,9 минут.Время удерживания капецитабина: около 2,8 минут.5.1.8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
