Диссертация (1139719), страница 33
Текст из файла (страница 33)
2.2.1) наносили на хроматографическиепластины марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А размером 10×10 см в количествах 10 и 5 мкл. Хроматографическое разделение проводили в выбранном элюенте в обоих направлениях. Вид полученных хроматограмм представлен на рис. 57 и 58.Рис. 57. Вид полученных двумерных хроматограмм извлечения из листьев крапивы двудомной(объем пробы 10 мкл). Проявитель - 0,2% раствор нингидрина в ацетоне161Рис.
58. Вид полученных двумерных хроматограмм извлечения из плодов облепихи крушиновидной (объем пробы 5 мкл). Проявитель - 0,2% раствор нингидрина в ацетонеДля каждой зоны АК на хроматограмме были рассчитаны величины относительных скоростей перемещения в слое сорбента (Rf), коэффициенты распределения (К) и селективностисорбции (L) (таблица 100).
Идентификацию зон осуществляли в сравнении с достовернымистандартными образцами 0,1% водных растворов АК: аргинин, глицин, глутаминовая кислота,пролин, фенилаланин, метионин, валин, лейцин. Вид двумерной хроматограммы разделениясмеси стандартных образцов АК изображен на рис. 59. При элюировании водного извлеченияиз листьев крапивы двудомной на хроматограммах наблюдалось девять зон. Анализ водногоизвлечения из плодов облепихи крушиновидной показал присутствие одиннадцати АК.Рис. 59. Вид полученных двумерных хроматограмм смеси стандартных образцов АК. Проявитель - 0,2% раствор нингидрина в ацетоне (1 – Arg; 2 – Pro; 3 – Gly; 4 – Glu; 5 – Val; 6 – Met; 7 –Leu; 8 – Phe)На хроматограммах выявлены общие зоны АК со значениями величин Rf=0,08±0,02(Arg); 0,26±0,02 (Pro); 0,36±0,02 (Gly); 0,40±0,02 (Glu); 0,48±0,02 (Val), 0,53±0,02 (Leu) и0,62±0,02 (Phe), среди которых к незаменимым относятся валин, фенилаланин и лейцин [99].Полученные расчетные данные величин селективности сорбции свидетельствуют об удовлетво-162рительном разделении зон на хроматограммах и правомерности использования данной методики (таблица 100).Таблица 100№зоны1RfИдентификация АК на хроматограммах [120]Цвет зонКLПараметры разделения смеси стандартных образцов АК0,08±0,0210,11розоваяАКArg0,26±0,022,852,15оранжево-розоваяPro0,36±0,021,781,60малиноваяGly0,40±0,021,501,19сиреневаяGlu0,48±0,021,081,39розоваяVal*0,50±0,021,001,08малиноваяМеt*0,53±0,020,891,12розоваяLeu*0,62±0,020,611,46розоваяPhe*Параметры разделения АК извлечения из листьев крапивы двудомной10,08±0,0210,11розоваяArgЗона не идентифи20,14±0,026,141,65розоваяцирована30,26±0,022,852,15оранжево-розоваяPro40,36±0,021,781,60малиноваяGly50,40±0,021,501,19сиреневаяGlu60,48±0,021,081,39розоваяVal*70,53±0,020,891,21розоваяLeu*80,62±0,020,611,46розоваяPhe*Зона не идентифи90,95±0,020,0512,20желтаяцированаПараметры разделения АК извлечения из плодов облепихи крушиновидной10,08±0,0210,11розоваяArgЗона не идентифи20,14±0,026,141,65розоваяцированаЗона не идентифи30,22±0,023,551,73розоваяцирована40,26±0,022,851,25оранжево-розоваяPro50,36±0,021,781,60малиноваяGly60,40±0,021,501,19сиреневаяGlu70,48±0,021,081,39розоваяVal*80,53±0,020,891,21розоваяLeu*Зона не идентифи90,56±0,020,791,13розово-сиреневаяцирована100,62±0,020,611,30розоваяPhe*Зона не идентифи110,95±0,020,0512,20желтаяцирована*- незаменимая АК.
Arg – аргинин; Gly – глицин; Gly – глутаминовая кислота; Met – метионин;Pro – пролин; Phe – фенилаланин; Leu – лейцин; Val – валин.2345678Неидентифицированные зоны АК, по литературным данным, могут быть отнесены к лизину (Rf=0,05±0,02), аспарагиновой кислоте (Rf=0,16±0,02), серину (Rf=0,15±0,02) и тирозину163(Rf=0,57±0,02) [99]. Хроматограммы аминокислотного состава извлечений из ЛРС имеют неодинаковый вид (рис.
57 и 58). В связи с этим, можно рекомендовать использовать хроматографический профиль АК для стандартизации сырья методом «отпечатков пальцев».4.4.2.2. Определение аминокислот в тонком слое с применением однократногоэлюированияВ настоящее время, согласно НД ЛРС крапивы двудомной и облепихи крушиновиднойне стандартизируется по содержанию АК [15,93], составляющих значительную долю гидрофильной фракции. Так, например, суммарное содержание свободных АК в различных образцахсырья крапивы двудомной и крапивы жгучей составляет от 10,8 до 68,9 мкг/мг, содержание связанных АК – от 15,3 до 154,1 мкг/мг [141]. Поэтому необходимо учитывать данный показательпри разработке новых проектов и изменении уже существующих ФС на ЛРС.Для исследования закономерностей хроматографического поведения в тонком слое АК,присутствующих в ЛРС, было изучено значение основного фактора, влияющего на параметрыэффективности хроматографического процесса: полярности элюента (более пятнадцати типовэлюирующих систем).
Наилучшее разделение и качество хроматографических зон было достигнуто в системе Б-У-В (4:1:1) со значением полярности 5,13 [266] при высоте пробегаэлюента не менее 13 см. Полученные извлечения из исследуемого ЛРС (Глава 2, п. 2.2.1) наносили на стартовую линию хроматографических пластин марок «Sorbfil» ПТСХ-П-А аналитические размером 10×15 см (тип сорбента: силикагель СТХ-1А; зернение: 5-17 мкм; толщина слоя:90-120 мкм; связующее: силиказоль).
Параллельно наносили 5 мкл смеси 0,1 % водных растворов стандартных образцов АК (рис. 60).Рис. 60. Вид хроматограммы извлечений: 1- из листьев крапивы двудомной (объем пробы 10мкл); 2 – из плодов облепихи крушиновидной высушенных (объем пробы 5 мкл); 3 - из плодов облепихи крушиновидной свежих (объем пробы 10 мкл); 4 – смесь 0,1% водных растворовстандартных образцов АК (объем пробы 5 мкл) после проявления 1,0% раствором нингидрина вспирте. 1 – Arg; 2 – Pro; 3 – Gly; 4 – Glu; 5 – Val; 6 – Met; 7 – Leu; 8 – Phe164Хроматографические пластинки обрабатывали 1,0 % раствором нингидрина в спирте,нагревали в сушильном шкафу при температуре 105 °С в течение 2-3 минут. Вид полученныххроматограмм представлен на рис.
60. Результаты расчета величин R f АК для трека смеси стандартных образцов приведены в таблице 101. Для каждой хроматографической зоны были рассчитаны величины Rf, К и L, а также Н и N (таблица 102).В случае изучения состава АК и выделения отдельных компонентов с использованиемметода ТСХ, селективность сорбции является одной из основных характеристик эффективностипроцесса. Разделение двух соседних зон считается полным при L≥1 [39].
Идентификация зон нахроматограммах в сравнении с достоверными стандартными образцами (ЗАО «Вектон», СПб,Россия) представлена в таблице 102. Значения величины селективности сорбции соответствуюткритерию приемлемости, а также свидетельствуют об удовлетворительном разделении хроматографических зон на хроматограммах и правомерности использования данной методики (таблица 102).Таблица 101Значения Rf стандартных образцов АК в системе БУВ 4:1:1 [119,169,297,298]№ п/пАКRf±0,02Окраска зоны в видимом свете1Arg0,06темно-розовая2Pro0,30оранжевая3Gly0,35оранжево-розовая4Glu0,46малиновая5Val0,52розовая6Met0,56розовато-сиреневая7Leu0,58розовая8Phe0,64сиреневаяТаблица 102№зоны1123456789123Хроматографические параметры зон АК на хроматограммах [119,169,297,298]Окраска зоныИдентификацияRfКLNH, ммв видимом светезон2345678Извлечение из листьев крапивы двудомной0,07±0,0113,2968,541,78Темно-розоваяArg0,15±0,025,672,3487,771,39розовая0,32±0,022,131,10 128,420,95оранжеваяPro0,35±0,011,861,14 114,021,07 оранжево-розоваяGly0,46±0,0051,171,59 100,991,21малиноваяGlu0,52±0,010,921,27 156,410,78розоваяVal*0,58±0,0050,721,28 174,290,70Розово-сиреневаяLeu*0,64±0,020,561,29 187,690,65розоваяPhe*0,68±0,020,471,19 203,300,60желтаяИзвлечение из плодов облепихи крушиновидной высушенных0,06±0,0220,2829,984,17Темно-розоваяArg0,17±0,024,884,1676,221,64розовая0,26±0,022,851,7164,431,94розовая-165145678910111223456780,29±0,022,451,2057,082,19розовая0,32±0,022,131,1561,582,03оранжеваяPro0,35±0,011,861,1486,211,45 оранжево-розоваяGly0,37±0,0061,701,1093,981,33сиреневая0,42±0,021,381,23 260,420,48розово-сиреневая0,46±0,0051,171,05 114,681,08малиноваяGlu0,58±0,0050,721,63 183,820,68розово-сиреневаяLeu*0,64±0,020,561,29 160,260,78сиреневаяPhe*0,68±0,020,471,19 446,430,28желтаяИзвлечение из плодов облепихи крушиновидной свежих10,26±0,022,855,4421,33розовая20,32±0,022,131,34 119,590,97оранжеваяPro30,35±0,011,861,1499,151,17 оранжево-розоваяGly40,42±0,021,381,35 161,110,72розовая50,46±0,0051,171,18 181,250,64малиноваяGlu60,58±0,0050,721,64 160,890,72розово-сиреневаяLeu*70,68±0,020,471,53 500,000,27желтая«-» зона не идентифицирована.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
