Диссертация (1139719), страница 32
Текст из файла (страница 32)
Поэтому для набухания ЛРС и проникновения экстрагента в клетки с последующим растворением ивыходом их содержимого, требуется более длительное время воздействия воды очищенной(таблица 94).Таблица 94Результаты сравнительного определения суммы ОК в исследуемых объектах [285,309]№ИсследуемоеНайдено суммы свободных ОК*, %п/пизвлечениеКрапивы двудомПлоды облепихиной листьясвежиевысушенные1 Настой/отвар по мето1,559±0,11613,435±0,1686,277±0,078дике ГФ XIII2 Настой (рекомендация1,460±0,108на упаковке)12,874±0,16113,792±0,1723Методика автора4,450±0,330* - в пересчете на абсолютно сухое сырье и кислоту яблочную156№ п/п12Таблица 95Метрологическая оценка метода анализа (P = 95 %; n = 5)ЛРСМетрологическая характеристикаПлоды облепихи крушиновидной выxср±∆xcp,%=13,792±0,1720;2сушенныеS =0,011760; S=0,10844; ∆x=0,3448;Sxcp=0,05422; εср, %=1,25Листья крапивы двудомнойxср±∆xcp,%= 4,010±0,297; S2=0,0567;S=0,238; Sxcp=0,1067; ∆x=0,662;εср, %=7,41Качественный состав свободных ОК в исследуемых извлечениях оценивали методомТСХ, для чего на первом этапе работы была подобрана оптимальная хроматографическая система, позволяющая идентифицировать и разделить ОК.
В качестве стандартных образцов использовали 0,2% водные растворы щавелевой, винной, аскорбиновой, лимонной, яблочной иянтарной кислот. В эксперименте изучены элюирующие системы, чаще всего предлагаемые влитературе для разделения и идентификации ОК, с различными значениями полярности[286,309] (таблица 96). В качестве проявителя был выбран 0,2% спиртовый раствор бромкрезолового зеленого по критерию качества получаемой картины.
ОК проявлялись на хроматограммах в видежелтых пятен на синем фоне.Таблица 96Подвижные фазы№ п/пСостав системР1Б-МК-В (5:0,5:2)5,472Б-У-В (4:1:5)6,683Э-МК-В (3:1:1)5,784Э-У-МК-В (100:11:11:25)5,44Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; Б – бутанол; МК – муравьиная кислотаЛучшее разделение и качество хроматографических зон достигнуто при использовании системы №4, поэтому она выбрана для идентификации ОК в извлечениях из ЛРС.
Вид полученных хроматограмм представлен на рис. 54. Для использованных стандартных образцов ОК в отобранной хроматографической системе были рассчитаны величины Rf и К (таблица 97) согласно известным формулам, приведенным также в Главе 2 (п. 2.9.4).Таблица 97Хроматографические параметры ОК [285]№ п/пОКRfК1ЩК0,14±0,016,142ВК0,36±0,011,783ЛК0,39±0,011,564АсК0,62±0,010,615ЯК0,80±0,020,256ЯнК0,93±0,010,08ЩК- щавелевая кислота; ВК – винная кислота; ЛК – лимонная кислота; АсК – аскорбиноваякислота; ЯК – яблочная кислота; ЯнК – янтарная кислота157Рис. 54.
Вид хроматограммы стандартных образцов ОК в системе №4: 1 – ЩК; 2 – ЛК; 3 - ЯнК;4 – АсК; 5 – ВК; 6 – ЯК. Объем пробы 5 мклИзвлечения из исследуемого ЛРС в количествах 5 и 10 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластины марки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А. Оптимальный объем пробысоставил 10 мкл. Вид полученных хроматограмм представлен на рис. 55.Рис. 55. Вид полученных хроматограмм ОК извлечений из ЛРС: 1 –листья крапивы двудомной;2 –плоды облепихи крушиновидной высушенные; 3 - плоды облепихи крушиновидной свежиеИдентификация зон на хроматограммах представлена в таблице 98. Значения селективности сорбции свидетельствуют об удовлетворительном разделении на хроматограмме зон ОКи правомерности использования данной методики [39].Способ получения извлечения, согласно экспериментальным данным, не оказывает влияния на состав свободных ОК в нем.
Однако, набор свободных ОК в ЛРС зависит от способаего консервации. Зона лимонной кислоты идентифицирована в извлечениях из высушенныхплодов облепихи крушиновидной, отсутствующая на хроматограмме извлечения из свежихплодов (таблица 98).158Таблица 98Результаты исследования состава ОК в извлечениях из ЛРС методом ТСХ [309,322]№LОбъекты исследованияRf±0,02КОКп/п6,143,450,13ЩК1Крапивы двудомной листья1,780,35ВК6,143,450,13ЩК1,141,780,35ВК2Облепихи высушенные плоды6,241,560,40ЛК0,250,78ЯК6,143,450,13ЩК7,121,783Облепихи свежие плоды0,35ВК0,250,78ЯКЗдесь и далее: ЩК- щавелевая кислота; ВК – винная кислота; ЛК – лимонная кислота; АсК –аскорбиновая кислота; ЯК – яблочная кислота; ЯнК – янтарная кислотаОК в свежих плодах содержатся как в свободном, так и в связанном состоянии (простыеи сложные эфиры по карбоксильным и гидроксильным группам).
В клеточном соке ЛРС в процессе высушивания при температуре 600 протекают процессы ферментативного и неферментативного гидролиза, что оказывает влияние на качественный состав свободных ОК.ТСХ широко применяется, преиммущественно, для исследования качественного составасвободных ОК в извлечениях из ЛРС. Соли ОК как при алкалиметрическом титровании, так иметодом ТСХ, определить не представляется возможным. Специфический профиль свободныхОК в солевой и кислотной формах установлены методом КЭ. Результаты приведены в таблице99. Электрофореграмма смеси ОК представлена на рис.
56.Рис. 56. Электрофореграмма градуировочной смеси ОК (1 – ЩК; 2 – муравьиная кислота; 3 –фумаровая кислота; 4 – ЯнК; 5 – ЯК; 6 – ЛК; 7 – уксусная кислота; 8 – пропионовая кислота; 9 –МК; 10 – бензойная кислота; 11 – сорбиновая кислота)159Чувствительность обнаружения ОК методом КЭ по сравнению с методом ТСХ на порядок ниже, поэтому не все ОК, идентифицированные на хроматограммах, были определены наэлектрофореграммах ввиду их малого содержания в извлечениях из ЛРС.Таблица 99Исследование специфического профиля свободных ОК методом КЭ в объектах анализа (в пересчете на абсолютно сухое сырье)№ОКНайдено ОК, %п/пКрапивы двудомной листьяОблепихи крушиновидной плодывысушенные1ЯКМенее 0,058,922ЯнК0,110,373МлКМенее 0,05Менее 0,054МК0,56Менее 0,12МК – молочная кислота; ЯК – яблочная кислота; ЯнК – янтарная кислота; МлК – масляная кислотаМетод КЭ является наиболее информативным, так как дает возможность за одну аналитическую процедуру провести качественное и количественное определение свободных ОК вкислотной и солевой формах в ЛРС.
Таким образом, полные сведения о составе и количественном содержании ОК возможно получить только при комбинировании методов ТСХ и КЭ.4.4.2. Исследование аминокислотного состава извлечений из растительных объектовфизико-химическими методамиСовершенствование подходов к стандартизации ЛРС приводит к необходимости количественной оценки основных классов БАВ, одним из которых являются АК, важность для живогоорганизма которых трудно переоценить. Широкий спектр фармакологического действия и способность увеличивать биодоступность других БАВ АК привлекают все большее внимание исследователей. Растения, в отличие от животных, способны синтезировать все АК, необходимыедля синтеза белковых макромолекул, поэтому изучение качественного состава и количественного содержания АК в ЛРС и полученных на его основе ФП имеет большое практическое значение и определенный научный интерес [99].4.4.2.1.
Определение АК методом двумерной ТСХИзвлечение из листьев крапивы двудомной и плодов облепихи крушиновидной получаликак описано в Главе 2 (п. 2.2.1).Качественный анализ на присутствие АК проводили по реакции со спиртовым растворомнингидрина. Фиолетовое окрашивание указывало на наличие АК в исследуемых извлечениях[251]. Нингидриновая реакция – цветная проба на вещества, имеющие в составе первичные ивторичные аминогруппы. Строго говоря, она не является специфичной только для АК, а приме-160няется также для определения иминокислот, аминов и др. соединений. Однако, согласно литературным данным [15,20,99,100,112-115,128,129,141,148,206,218,247,252,264,358,378], основными классами гидрофильных БАВ в исследуемых видах ЛРС являются флавоноиды, ДВ, ОК,хлорофиллы, стерины, лигнаны и минеральные соли.
Плоды облепихи дополнительно содержатзначительное количество жирного масла, богатого ФЛ (содержат аминогруппы), не способныизвлекаются в водную вытяжку. Поэтому полученное окрашивание обусловлено присутствиемсвободных АК.Экспериментально изучены более пятнадцати типов элюирующих систем в широкомдиапазоне полярности, рекомендованных в литературе. При однократном элюировании и стандартной длине пробега элюента (8-9 см) ни одна из исследованных систем не приводила к удовлетворительному разделению зон АК на хроматограммах.
Применение двумерного хроматографирования позволило решить данную проблему и справиться с поставленной задачей. Двумерная ТСХ, в отличие от одномерной, по разрешающей способности сопоставима с колоночной хроматографией [39]. Наилучшая степень разделения и качество хроматографических зонбыло достигнуто в системе н-бутанол-кислота уксусная ледяная-вода (4:1:1) со значением полярности 5,13 [266].Выбор проявителя осуществляли на основании требований высоких специфичности,чувствительности, доступности и качества получаемой картины разделения. Хроматограммыобрабатывали 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне, образующим с АК аммонийную сольенольной формы дикетогидринденкетогидринамина со стойкой сине-фиолетовой окраской[251], термостатировали при температуре 105°С в течение 2-3 минут.Исследуемые извлечения из ЛРС (Глава 2, п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
