Диссертация (1139719), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Градуировочные графики для определения содержания танина в области концентраций (0,5 – 4,5 и 5,0 – 7,0 мкг/мкл); б. Градуировочный график для определения содержаниякверцетина в области концентраций (1,0 - 6,0 мкг/мкл); в. Градуировочные графики для определения содержания галловой кислоты в области концентраций (0,3 –1,5 и 1,5 – 4,0 мкг/мкл)Ошибка в определении содержания танина будет уменьшаться с увеличением «а» вуравнении y=ах+в, следовательно, применение градуировочного графика для определения содержания танина, где а = 6,0083 (рис. 43 а) приводит к более точным результатам по сравнениюс результатами, полученными по графику в диапазоне концентраций 0,5 – 4,5 мкг/мкл, где а =4,4805.
Ошибка в определении содержания галловой кислоты будет меньше с применением126градуировочного графика в области концентраций 0,3 – 1,5 мкг/мкл, где а = 16,601 (рис. 43 в)по сравнению с результатами, полученными по графику в диапазоне концентраций 1,5 – 4,0мкг/мкл, где а = 4,8778. Наличие в регрессионных уравнениях коэффициентов b, отличных отнуля, говорит о постоянной систематической ошибке, обусловленной влиянием яркости фонапластины, на оценку яркости окрашенной хроматографической зоны при обработке хроматограммы компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».Разработанная методика была апробирована на изучаемом ЛРС. Извлечение из исследуемого ЛРС готовили по ОФС ГФ ХIII изд.
«Настои и отвары» [93]. Полученные вытяжки хроматографировали восходящим способом в условиях разработанной методики. Вид хроматограмм представленна рис. 44.абРис. 44. Вид хроматограммы водных извлечений из ЛРС (а – 20 мкл отвара плодов облепихикрушиновидной высушенных; б – 10 мкл настоя листьев крапивы двудомной)Сразу же после проявления хроматограмм, пластины сканируют, а полученные изображения обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Результаты идентификации и количественного определения изучаемых БАВ в извлеченииях из ЛРС, а также метрологическая характеристика представлены в таблице 69.Для каждой хроматографической зоны на хроматограммах были рассчитаны величиныселективности сорбции (L) (таблица 69), свидетельствующие об удовлетворительном разделении хроматографических зон полифенольных БАВ на хроматограммах и правомерности использования данной методики.Таким образом, разработана методика разделения и количественного определения полифенольных БАВ при совместном присутствии (на примере танина, галловой кислоты и кверцетина) методом фронтальной ТСХ.
Методика может быть использована в контроле качествасубстанций, монокомпонентных и комплексных препаратов, ЛРС и БАД.127Таблица 69Результаты количественного определения полифенольных БАВ в ЛРС (в пересчете на абсолютно сухое ЛРС)№п/п123Методика ТСХЛРСЛистья крапивыдвудомнойПлоды облепихикрушиновиднойвысушенныеКора дуба обыкновенногоИдентификация БАВНеидентифицированная зонаСодержание БАВ,%RfL0,03±0,00316,650,34±0,021,94Кверцетин0,50±0,021,38Танин0,58±0,022,90Неидентифицированная зона-0,80±0,02-Галловая кислота0,5785±0,0557εср=9,62%0,06±0,00347,480,75±0,021,320,83±0,02-Галловая кислота0,04±0,00224,00Неидентифицированная зона0,50±0,025,00Танин0,83±0,02-Галловая кислотаНеидентифицированная зонаНеидентифицированная зона0,6434±0,0395;εср=6,14%0,7243±0,0156;εср=2,15%0,04076±0,0012;εср=2,94%0,90785±0,03298;εср=3,63%0,09313±0,0042;εср=4,51%3.2.5. Количественное определение простых сахаров в тонком слое сорбентаАнализ литературы за последние 20 лет показал, что при контроле качества ЛП, содержащих моносахариды, при исследовании состава простых сахаров в полисахаридных комплексах ЛР и не только, предпочтение отдается физико-химическим методам, как наиболее экспрессным, чувствительным и информативным [116,124,131,153,168,205,210].Более объективный качественный и количественный анализ позволяют получить хроматографические методы, из которых наибольшее распространение получила ВЭЖХ [140] иГХ/МС.
ГХ/МС – наиболее быстрый и точный метод анализа различных групп БАВ, в том числе и класса углеводов. Однако, следует отметить, что высокая стоимость оборудования и нехватка квалифицированных кадров существенно ограничивает практическое использование метода.128Значительное число научных публикаций посвящено исследованию состава как свободных, так и связанных простых сахаров в полисахаридных комплексах растительных объектовметодом ТСХ [96,161,263,371].В качестве стандартных образцов для разработки методики использовали такие представители восстанавливающих гексоз и пентоз, наиболее распространенных в растительных объектах, как глюкоза, ксилоза и рамноза.Основными факторами при выборе проявителя являются специфичность, чувствительность, доступность и высокое качество получаемой картины. В качестве реагентов для обнаружения зон моносахаридов были использованы реагенты, приведенные в таблице 70.При разработке методики предложен новый состав детектирующего реагента для идентификации зон моносахаридов на хроматограммах (0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевойкислоты в 50 мл 95% этилового спирта), который является менее токсичным по составу по сравнению сизвестным анилинфталатным реактивом (анилин – яд), пары которого ядовиты.
Замена в составе анилина насульфаниламид и бутанола на этанол приводит к снижению токсичности реагента, не нарушая химизма, лежащего в основе детектирования сахаров (образование окрашенных оснований Шиффа). Пределы обнаружения моносахаридов с использованием предложенного проявителя приведены в таблице 71.Таблица 70Детектирующие реагенты, использованные для обнаружения зон моносахаридов в тонком слоесорбентаОкрашивание хроматограПримечание№фических зонОткрывающий реагентп/пв видимом светеЖелто-коричневые зоны на1Анилинфталатный реактивСпецифичныйбелом фоне1% спиртовый раствор пик- Красно-оранжевые зоны наРазмытые зоны слабой2риновой кислотыжелтом фонеинтенсивности0,1 М раствор водный нит- Коричнево-черные зоны на Размытые зоны (отслойка3рата серебрабелом фонесорбента от подложки)2% спиртовый раствор резорцина и 2 М раствор кисРозовые зоны на беломНедостаточная кон4лоты хлористоводороднойфонетрастность зон и фона(1:9)Синие зоны на желто55 % спиртовый раствор ФМКНеспецифичныйзеленом фонеТаблица 71Пределы обнаружения моносахаридов с использованием раствора, содержащего 0,86 г сульфаниламида и 0,83 г о-фталевой кислоты в 50 мл 95% этилового спирта№ п/п Детектирующий реагентПредел обнаружения, г в зоне1глюкоза2,5·10-62ксилоза2,5·10-63рамноза5·10-6129В эксперименте было изучено более двадцати типов элюирующих систем с различнымизначениями полярности (таблица 72), как предложенные в литературе, так и новые элюенты.
Данные таблицы 72 показывают, что оптимальные величины Rf для всех изучаемых стандартныхобразцов, достигнуты в системах № 2, 3, 5-7, 9, 14 и 18 со значениями полярности (по Л. Снайдеру) [266] в диапазоне от 4,42 до 5,69 ед. (рис. 45).Таблица 72Хроматографические параметры моносахаридов в различных элюирующих системахRf±0,02№ЭлюентРп/пглюкозаксилозарамнозаБ3,9010,l470,2670,3472Б-У-В (4:l:2)5,690,2890,4520,5483Б-У-В (4:l:l)5,l30,3800,5200,5954Б-У-В (8:l:l)0,2394,640,4200,5295Б-У-В (7:l:l)4,720,3290,4l90,4866Б-У-В (6:l:l)4,830,3330,4590,5l47Б-У-В (5:l:l)4,960,36l0,4580,5288Б-У-В (3:l:l)0,6605,380,4980,5949Б-У-В (4:l:5)5,280,2950,3290,52610Б-У-В (l:2:l)0,6790,6890,6956,3311Б-У-В (l:4:l)0,6820,7000,7206,2812Б-У-В (l:l:6)0,7800,7850,8008,0l13Б-У-В (l:6:l)0,7240,6570,7306,2614Б-У-В (9:l:l)4,570,3490,4880,56615Б-У-В (2:l:l)0,6l40,6875,750,56616Б-У-В (1:l:l)0,64l0,6790,6926,3717Б-У-В (l0:l:l)0,6l34,520,3750,50018Б-У-В (l2:l:l)4,420,3250,4690,56619Б-А-В (4:5:l)0,7250,7905,l60,58820Б-П-В (6:4:3)0,6500,7400,7655,5l21Э-И-МК (l0:7:3)0,6604,640,4550,60222Э-МК-В-У (l8:l:4:3)0,l500,2855,350,42223Б-А-В (3:l:l)0,5370,6635,220,43824Б-А-В (4:l:l)0,5000,6505,000,37825Б-А-В (4:l:2)0,4360,64l5,570,320Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; Б – бутанол; МК – муравьиная кислота;А – ацетон; П – пиридин: И - изопропанолПри детальном изучении влияния полярности системы на величину Rf , были выбраныинтервалы значений Р элюента, в котором данные зависимости становятся линейными (таблица73, рис.
46). Параметры линейных зависимостей (коэффициенты корреляции, уравнения прямых и диапазоны линейности) приведены в таблице 73.С помощью предложенных зависимостей можно подбирать различные системы для разделения моносахаридов в тонком слое сорбента, таким образом, чтобы величина Rf укладывалась в оптимальные значения. Интервалы полярностей элюента представлены в таблице 73.1301Глюкоза0,9КсилозаВеличина Rf0,80,7Рамноза0,60,50,40,30,20,100123456Полярность системы (Р)78910Рис.
45. Вид зависимости величины Rf моносахаридов от полярности элюента0,8ГлюкозаКсилозаРамноза0,7y = 0,075x + 0,1409R² = 0,9727Величина Rf0,60,5y = 0,4367x - 1,3736R² = 0,99370,4y = 0,2321x - 0,7789R² = 0,96160,30,20,1033,544,555,5Полярность подвижной фазы, ед. пол.66,5Рис. 46. Линейная зависимость величины Rf моносахаридов от значения полярности элюентаТак как, в основном, в качестве оптимальных были признаны системы типа БУВ с различным соотношением компонентов, при варьировании содержанием н-бутанола, уксуснойкислоты и воды в трехкомпонентной подвижной фазе (таблица 72), были получены кривые зависимости величины относительной скорости перемещения моносахаридов от процентного содержания каждого компонента в элюенте (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
