Диссертация (1139719), страница 25
Текст из файла (страница 25)
32,вид кривых изучаемых АК, за исключением пролина и аргинина, сходен между собой. При достижении величины Р= 6,75 ед. и более, значение параметра Rf определяемых веществ перестает зависеть от полярности элюента.Особенные трудности могут возникнуть при отделении лейцина от фенилаланина и метионина от валина. Следовательно, для достижения наилучшего разделения необходимо работать при определенных полярностях систем [334].114Рис.
32. Вид зависимости величины Rf АК от полярности элюентаДетальное изучение влияния полярности системы на величину Rf , были выбраны интервалы значений Р элюента, в котором данные зависимости становятся линейными (таблица 60,рис. 33). С помощью предложенных зависимостей можно подбирать различные системы дляопределения АК в тонком слое сорбента, таким образом, чтобы величина Rf укладывалась в оптимальные значения [39]. Интервалы полярностей элюента представлены в таблице 60.При варьировании содержанием н-бутанола, уксусной кислоты и воды в трехкомпонентной подвижной фазе (таблица 59), получены кривые зависимости величины относительной скорости перемещения АК от процентного содержания каждого компонента в элюенте (рис. 34).Рис.
33. Линейные зависимости величины Rf АК от значения полярности элюента115Таблица 60Характеристики линейных зависимостей значения подвижности АК от полярности элюента втонком слое сорбента№АКПараметры линейностип/пУравнениеДиапазон лиКоэффи- Диапазон полярнопрямойнейной зависициентсти элюента дляy = ax+bмости, ед. покорреляполучения оптилярностиции (R2)мальных величинRf1Argy = 0,l293x – 0,54083,90 – 8,0l0,95456,50 – 8,822Glyy = 0,3074x – l,20723,90 – 5,540,92434,90 – 5,883Gluy = 0,6l9lx – 2,794l5,l3 – 6,000,96l55,00 – 5,484Valy = 0,4669x – l,82933,90 – 5,270,96464,56 – 5,205Leuy = 0,5433x – 2,10073,90 – 5,270,97894,42 – 4,976Mety = 0,477x – 1,8583,90 – 5,270,98174,52 – 5,157Proy = 0,2982x – 1,19633,90 – 5,540,90565,02 – 6,028Phey = 0,5243x – 2,00393,90 – 5,270,98514,39 – 4,97Arg – аргинин; Gly – глицин; Gly – глутаминовая кислота; Met – метионин; Pro – пролин; Phe –фенилаланин; Leu – лейцин; Val – валин.Полученные зависимости также позволили установить соотношения н-бутанола, уксусной кислоты и воды в системе, необходимые для достижения оптимальной величины Rf каждойАК.
Результаты представлены в таблице 61.Таблица 61Оптимальное соотношение Б-У-В в трехкомпонентной подвижной фазе при разделении АК методом ТСХ [334]№АКСодержание компонентов в элюенте, % (по объему)п/пБУВ1Arg10-2525-7525-752Gly40-7015-7512-173Glu60-8010-2510-174Val40-807-257-155Leu70-905-155-156Met40-807-257-157Pro17-6715-7515-608Phe70-905-155-15Однако, при совместном определении большого количества веществ, определяющее значение в хроматографии имеет значение параметра селективности сорбции (L) (таблица 62).Установлено, что наилучшее разделение хроматографических зон АК достигается в системах(таблица 62) № 6-9 и 16 (интервал полярностей 5,13 – 5,69).
В то же время, с точки зрения эффективности хроматографического процесса, характеризующейся величинами высоты, эквивалентной теоретической тарелке (Н, мм) и числом теоретических тарелок (N), наилучшей, дляразделяемых веществ, являются системы № 6 и 16 (таблица 63). Вид полученных в системе № 6хроматограмм представлен на рис. 35.116Рис. 34 а.
Зависимость относительной скорости перемещения АК от содержания н-бутанола вподвижной фазе (неподвижная фаза – силикагель) [334]Рис. 34 б. Зависимость относительной скорости перемещения АК от содержания воды в подвижной фазе (неподвижная фаза – силикагель)Рис. 34 в. Зависимость относительной скорости перемещения АК от содержания ледяной уксусной кислоты в подвижной фазе (неподвижная фаза – силикагель)117Таблица 62Параметры хроматографического разделения смеси стандартных образцов исследуемых АК[334]Эффективность разделения в системе№ п/п АК№6№7№8№9№ 16KLKLKLKLKL1Phe0,470,430,770,460,432Leu0,561,190,481,120,85 1,10 0,60 1,30 0,48 1,123Мet0,811,450,781,631,07 1,26 0,85 1,42 0,78 1,634Ваl0,931,150,911,171,49 1,39 1,02 1,20 0,91 1,175Glu1,862,001,271,402,33 1,56 0,47 1,02 0,59 1,326Gly1,971,061,701,343,83 1,64 2,40 1,27 1,70 1,877Pro2,411,221,801,064,00 1,04 1,89 1,85 1,80 1,068Аrg8,353,465,903,286,14 1,54 4,78 1,99 5,90 3,28Здесь и в таблице 63: Arg – аргинин; Gly – глицин; Gly – глутаминовая кислота; Met – метионин; Pro – пролин; Phe – фенилаланин; Leu – лейцин; Val – валин.Таблица 63Параметры эффективности хроматографирования исследуемых АК [334]Эффективность разделения в системе№ п/п АК№6№7№8№9№ 16HNHNHNHNHN1Arg0,44179,550,75104,001,3360,901,14 66,67 0,35 228,572Gly0,8987,641,2063,331,4752,380,64 125,00 1,1468,423Glu0,36186,110,26291,831,0472,000,16 468,75 0,17 464,714Val0,37210,810,21366,670,48160,42 0,21 380,95 0,15 520,005Leu0,17458,820,30250,000,20390,00 0,30 266,67 0,13 600,006Met0,35222,860,54142,590,40195,00 0,20 400,00 0,38 205,267Pro0,30256,670,53149,060,9485,110,89 85,39 0,58 134,488Phe0,65116,920,41200,000,52153,85 0,64 120,31 0,34 229,41Рис.
35. Вид хроматограммы смеси стандартных образцов АК при хроматографировании в системе Б-У-В (4:1:1) после проявления 1,0% раствором нингидрина в спирте: 1 – Arg; 2 – Pro; 3 –Gly; 4 – Glu; 5 – Val; 6 – Met; 7 – Leu; 8 – Phe118В результате, по совокупности экспериментально полученных и теоретически рассчитанных данных выбраны оптимальные условия для разделения изучаемых АК в тонком слоесорбента: пластинки силикагелевые хроматографические марки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А илиПТСХ-АФ-В размером 10×10 см; элюент: Б-У-В (4:l:l) или Э-МК-В (4:l:l); детектирующий реагент – 1% спиртовый раствор нингидрина; оптимальный объем пробы – 1 мкл водного растворас содержанием АК 1 мг/мл; время насыщения камеры парами элюента – 40 мин; время развитияхроматограмм – 55 мин; время термостатирования после проявления при t º = 80 - 100 ºС – 3-5минут.Таким образом, показана возможность теоретического подхода к выбору оптимальныхусловий хроматографического разделения АК в тонком слое сорбента, т.е.
возможность прогнозирования значения величин Rf исследуемых АК по уравнениям линейных зависимостей приизвестном значении полярности элюента. При совместном определении для достижения оптимальных величин Rf и наилучшего разделения следует работать в интервале от 5,13 до 5,69 ед.полярности системы. На основе установленных закономерностей, приведенных в работе, могутбыть разработаны различные методики, которые в зависимости от целей анализа и предполагаемого состава АК, найдут применение в контроле качества как моно-, так и комбинированныхаминокислотных препаратов, витаминных комплексов четвертого поколения, а также для разделения и идентификации свободных АК в сумме, присутствующей в ЛРС и ФП.3.2.3.1.
Количественное определение глутаминовой кислоты методом ТСХДля проведения количественного определения глутаминовой кислоты в сумме свободных АК изучаемого ЛРС, на следующем этапе работы была разработана методика идентификации и количественногоопределения АК методом ВЭТСХ [204]. Сразу же после проявления зон на калибровочных хроматограммах, пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученныеизображения (рис. 36) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».В результате получают треки в координатах Rf – интенсивность (рис. 37). Установлена линейнаязависимость между содержанием глутаминовой кислоты и площадью хроматографической зоны (рис.
38) в диапазоне изучаемых концентраций (0,05 – 0,35%). Наличие в регрессионномуравнении y=ах+b коэффициента b, отличного от нуля и равного 13560, говорит о постояннойсистематической ошибке, обусловленной влиянием яркости фона пластины на оценку яркостиокрашенной хроматографической зоны при обработке хроматограммы компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».1191234567Рис. 36. Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов (0,05 – 0,35%) глутаминовой кислоты (проявитель - 1% спиртовый раствор нингидрина): 1 – 0,5 мкг; 2 – 1 мкг; 3 –1,5 мкг; 4 – 2 мкг; 5 – 2,5 мкг; 6 – 3 мкг; 7 – 3,5 мкг. Объем пробы 1 мклРис.
37. Аналоговая кривая стандартного раствора глутаминовой кислотыРазработанная методика идентификации [119,169] и количественного определения глутаминовой кислоты была апробирована на ЛРС (на примере листьев крапивы двудомной и пло-Площадьхроматографической зоныдов облепихи крушиновидной).70000y = 18190x + 13560R² = 0,97075500040000250001000000,511,522,533,54Содержание глутаминовой кислоты в пробе, мкгРис. 38. Градуировочный график для определения содержания глутаминовой кислоты в областиконцентраций (0,05 – 0,35 %)Приготовление извлечения из листьев крапивы двудомной: Около 2,5 г измельченногоЛРС (т.н.) до размера частиц менее 0,5 мм экстрагировали в конической колбе объемом 100 мл120воды очищенной в соотношении 1:10 (с учетом коэффициента водопоглощения) на кипящейводяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин.
Извлечение после охлаждения докомнатной температуры фильтруют, отжимая ЛРС, в мерную колбу объемом 25 мл. При необходимости доводят объем до метки экстрагентом.Приготовление извлечения из плодов облепихи: Около 10,0 г (т.н.) высушенных или свежих измельченных плодов облепихи крушиновидной экстрагировали водой очищенной в конической колбе объемом 100 мл в соотношении 1:5 на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 60 мин, периодически встряхивая для смывания частиц ЛРС со стенок.Извлечение после охлаждения до комнатной температуры фильтруют, отжимая ЛРС, в мернуюколбу объемом 50 мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
