Диссертация (1139719), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Интенсивности окраски хроматограммы, обра-91ботанных этим реагентом, не изменяется со времени. Предел обнаружения с помощью выбранногодетектирующего реагента, как установлено, составляет 3 мкг в зоне [238,365].Определяющее влияние на поведение веществ в тонком слое сорбента оказывает растворитель. Исследованы системы, описанные в литературе [174,290, 364], а также новая однокомпонентнаяхроматографическая система – хлороформ [365]. Параметры, демонстрирующие эффективностьхроматографического определения α-токоферола в различных элюирующих системах представлены в таблице 40.Из данных таблицы 40 следует, что наибольшая эффективность хроматографическогопроцесса, по данным рассчета величин N, достигаются в системах № 2, 3 и 7.
Оптимальные величины Rf [39] α-токоферола наблюдаются в системах № 4,7 и 8.Таблица 39Сравнительная характеристика детектирующих реагентов для определениявитамина Е методом ВЭТСХ№ДетектирующийХарактеристика детектирующего реагентап/преагентизбира- чувствидоступкачество хромательность тельностьностьтограмм15 % спиртовый раствор++низкоеФМК210 % спиртовый растворгексацианоферрата калия+_+_(III)3Реактив Эммера – Энгеля++_низкое4 Спиртовый раствор нитра++_высокоета серебра5Конц.
азотная кислота+++высокое«+» - наличие признака; «-» - отсутствие признака.Таблица 40Параметры эффективности хроматографического определения α-токоферола в различных элюирующих системах№Подвижная фазаСоставРRfКН, ммNп/п1Х – Эт(3:1)4,150,97±0,010,030,371922345678Х – ЭтХ – ЭтХБ-ЭБ-ПЭГ-ЭО-ЭЭ(2:1)(1:1)(8:2)(1:1)(37:3)(7:1)4,164,204,103,263,360,480,440,95±0,010,94±0,010,59±0,020,85±0,020,80±0,020,29±0,020,30±0,020,050,060,690,180,252,452,330,230,320,550,980,780,340,5933025615680106253140Г– гексан; Х – хлороформ; Эт – этанол; Э – этилацетат; Б – бензол; О – октан; ПЭ – петролейный эфир;ЭЭ – этиловый эфирНесмотря на то, что величины N в системах № 2, 3 и 7 имеют более высокие значения,чем в системах № 4 и 8, обработка их затруднена, так как качество хроматографических зон92значительно хуже. В однокомпонентной системе № 4 было достигнуто наилучшее качество зонокруглой форму на хроматограммах [365], что свидетельствует о линейной изотерме сорбции αтокоферола в данных условиях [39].
Кроме того, трихлорметан как элюент является легкодоступным, дешевым и относительно малотоксичным.Оптимальными условиями хроматографирования, по совокупности полученных результатов,были выбраны следующие: сорбент – пластинки силикагелевые марки «Sorbfil» размером 10х10 см сполимерной подложкой; объем пробы – 10 мкл 0,3% спиртового раствора α-токоферола; элюент– хлороформ; обработка хроматограмм – конц. азотная кислота; время насыщения камеры парами элюента – 20 мин; время развития хроматограмм – 25 мин; время термостатирования при tº ≥ 80 ºС - 5 – 7 мин; предел обнаружения – 3 мкг в зоне.Количественное определение токоферолов методом тонкослойной хроматографииВ условиях, представленных выше, получены калибровочные хроматограммы с сериейстандартных растворов α-токоферола (рис. 15).
Пластины обрабатывают детектирующим реагентом,сушат, а затем сканируют с помощью планшетного сканера. Изображения хроматограмм в формате bmp(рис. 15) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer», принцип работы которой состоит в оценке размера и интенсивности окраски зон на хроматограммах по отношению к фону.1 23456Рис. 15. Вид хроматограммы с серией стандартных растворовα-токоферола (с = 0,3 – 5 %): 1 – 0,3 %; 2 – 0,5 %; 3 – 0,75 %; 4 – 1,5 %; 5 – 3 %; 6 – 5 %В результате получают денситограммы, где по оси абсцисс отложена величина Rf, а по оси ординат– интенсивность окраски. Центр зоны соответствует максимуму на треке, а площадь зоны – площади подкривой.
Истинный центр зоны не совпадает с геометрическим, особенно для зон вытянутой формы,поэтому при рассчете Rf с помощью данной программы получаются более правильные результаты, чемпри визуальном определении. Центром пятна считается область с наибольшей интенсивностьюокраски. Расчет площади при этом также является более точным, в виду того, что видимый размерхроматографической зоны гораздо меньше истинного [13,35,40,105,106,135,270].93По полученным с помощью программы «Sorbfil Videodensitometer» данным построена линейнаязависимость (рис. 16) площади хроматографической зоны от содержания α-токоферола в изучаемом диапазоне концентраций (0,03 – 5,0 %) [238].Нижний порог диапазона концентраций α-токоферола обусловлен чувствительностьюего обнаружения по разработанной методике, а верхний –максимально возможным содержанием витамина Е в растительных объектах [238,365].S, мм300y = 47,99x + 8,6422R² = 0,95792502001501005000123456С,%Рис.
16. Вид линейной зависимости площади хроматографической зоны от содержания αтокоферола (0,03 – 5,0 %)В результате, разработана методика количественной оценки данных ВЭТСХ на офисномкомпьютере, характеризующаяся экономичностью и экспрессностью. Разработанная методикабыла использована для определения α-токоферола в исследуемых ЛРС и МЭ, полученных наего основе, для исследования возможности ее применения в целях сквозной стандартизации(Том 2, Глава 7, п.
7.2.3.3).3.1.5. Разработка методики разделения и определения жирорастворимых витаминов присовместном присутствииРанее в данной Главе проведено изучение различных элюирующих систем и обоснована возможность теоретического подхода к выбору оптимальных условий хроматографическогоопределения отдельных жирорастворимых витаминов (ЖРВ) в тонком слое.
Однако, в виду того что растительные объекты содержат комплекс БАВ, в т.ч. и липофильной группы, возникаетнеобходимость в разработке методики их разделения и идентификации при совместном присутствии методом ТСХ.94Обобщенные данные по обнаружению хроматографических зон ЖРВ представлены втаблице 41.Таблица 41Характеристика детектирующих реагентов, использованных для идентификации ЖРВ методом ТСХ[314,315,335]Детектирующий ТокоферолаРетинола аце№ п/пЭргокальциферолβ-каротинреагентацетаттатна беломфоне краснооранжевыезоны-1Конц. азотнаякислота2Хлорид сурьмы(III)-Быстроисчезающее синее окрашивание3Конц.
хлорнаякислота--На белом фонеоранжевокоричневые зоны--Фиолетовые зонына белом фоне-Быстроисчезающеесинее окрашивание456Конц. сернаякислота5% спиртовый ФМКВидимый свет-Розовые зоны на Быстроисчезающеебелом фонесинее окрашиваниеНа желто-зеленом фоне темно-синие зоны----Желтооранжевые зоны на беломфонеАнализируя данные таблицы 41, можно сделать вывод о том, что ни один детектирующий реагент не может быть использован для одновременного проявления исследуемых ЖРВ.Пластинки после хроматографирования следует просматривать в видимом свете, а затем обрабатывать 5% спиртовым раствором ФМК.Для выбора оптимальных условий хроматографического разделения эргокальциферола,β-каротина, ретинола и токоферола ацетатов требовалось изучить влияние полярности элюентов на хроматографическую подвижность витаминов в тонком слое при совместном присутствии, так как данные, полученные по отдельным ЖРВ, могут искажаться ввиду наличия межмолекулярных связей в растворах, образования комплексов и конгломератов между БАВ в растительных объектах.
В эксперименте изучены ранее исследованные наиболее оптимальныеэлюирующие системы (таблица 42).Так как при использовании систем (гексан-хлороформ) были достигнуты оптимальныезначения величин Rf для большинства изучаемых ЖРВ, они были выбраны в дальнейших экспериментах. Изменение соотношения хлороформа и гексана, позволило получить кривые зависимостей величин R для каждого ЖРВ от объемной доли каждого растврителя в элюенте (рис.17). С помощью выявленных зависимостей было установлено, что для получения оптимальных,95с точки зрения практической ТСХ, величин Rf [39] cодержание хлороформа и гексана в подвижной фазе должно варьировать в узком диапазоне соотношений по объему (таблица 43).По экспериментально полученным результатам (таблица 43) строили кривую зависимости значения Rf ЖРВ (рис.
18) от суммарной Р системы в интервале от 0 до 4,4 ед. полярности.Таблица 42Значения величин R стандартных образцов ЖРВ А, Е, D2 и β-каротинаВеличина Rf№Состав элюентаРретинола токоферола эргокальцип/пβ-каротинацетатацетатферол1Г00,0l±0,00l0,0l±0,00l0,025±0,00l0,l9±0,0l0,0l±0,00l0,02±0,00l0,03±0,0022Г - Б (29:1)0,l50,38±0,0l0,0l±0,00l0,02±0,00l0,03±0,0023Г - Б (19:1)0,220,57±0,0l0,0l±0,00l0,08±0,00l0,03±0,0024Г - Б (14:1)0,290,69±0,0l5Г - Х (10:1)0,40 0,04±0,00l0,07±0,00l0,04±0,0020,9l±0,0l0,l3±0,00l0,98±0,0l6Г - Х (5:1)0,730,46±0,0020,27±0,020,98±0,0l7Г - Х (4:1)0,88 0,24±0,00l0,52±0,00l0,35±0,020,98±0,0l8Г - Х (3:1)l,l00,36±0,00l0,76±0,0020,67±0,029Г - Х (2:1)l,470,85±0,00l0,92±0,00l0,85±0,020,98±0,0l10Г - Х (1:1)2,20 0,92±0,00l0,95±0,00l0,93±0,020,98±0,0l11X4,40 0,95±0,00l0,98±0,00l0,99±0,0l0,99±0,0lГ – Б – гексан-бензол; Г – Х – гексан-хлороформ; Г – гексан; Х - хлороформ1Величина R f0,80,6Бета-каротин0,4ТокоферолаацетатРетинола ацетат0,2ЭргокальциферолВеличина R f10,8Бета-каротин0,6Токоферола ацетат0,4Ретинола ацетат0,2Эргокальциферол000020406080100Содержание хлороформа в п.
ф., % (пообъему)20406080100Содержание гексана в п. ф., % (пообъему)Рис. 17. Вид зависимости значения Rf ЖРВ от объемной доли хлороформа и гексана в элюенте(неподвижная фаза – силикагель)Таблица 43Рекомендуемое соотношение гексана и хлороформа в бикомпонентной системе при разделенииЖРВ методом ТСХ [335]№ЖРВСодержание компонентов, % (по объему)п/пГeксанXлороформ1Ретинола ацетат70-8020-302Токоферола ацетат75-85l5-253Эргокальциферол75-7723-254β-каротин94-96,73,3-696Как видно из данных таблицы 42 и рис. 18 для достижения оптимальных величин Rf βкаротина необходимо использовать элюенты с малыми значениями полярности [266] № 2-4 (от0,15 до 0,30 ед.).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
