Диссертация (1139719), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Определение содержания аскорбиновой кислоты в извлечениях из изучаемого ЛРСАликвоту извлечения из листьев крапивы двудомной, полученного, как описано выше (п.2.2.3. данной главы) объемом 5 мл, помещают в коническую колбу для титрования объемом 100мл, добавляют 5 мл 2 % раствора кислоты хлороводородной, 50 мл воды очищенной и титруютизпипеткиилимикробюреткисвежеприготовленным0,001Мраствором2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до образования устойчивого в течение 60 секунд слабо-70розового окрашивания. Содержание аскорбиновой кислоты (АсК) в абсолютно сухом сырье впроцентах (Х) вычисляют по формуле (3) [285]:V K 0,000088 250 100 1005 а (100 W )Х ,%(3)Аликвоту извлечения из плодов облепихи крушиновидной, полученного, как описановыше (п.
2.2.3) объемом 1 мл, переносят в коническую колбу для титрования объемом 50 мл,добавляют 1 мл 2 % раствора кислоты хлороволородной, 25 мл воды очищенной и титруют изпипетки или микробюретки свежеприготовленным 0,001 М раствором 2,6 - дихлорфенолиндофенолята натрия до появления устойчивого в течениие 60 секунд слабо-розового окрашивания.Содержание АсК в абсолютно сухом сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле 4:Х ,%V K 0,000088 50 100 100а (100 W )(4)где 0,000088 – количество АсК в граммах, соответствующее 1 мл 0,001 моль/л раствора 2,6дихлорфенолиндофенолятанатрия;V–объём0,001моль/лраствора2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в миллилитрах, пошедшего на титрование; а – масса ЛРС, г;W – влажность ЛРС, % [185].2.2.6.
Определение суммы гидроксикоричных кислот в изучаемом ЛРСОпределение суммы гидроксикоричных кислот (ГКК) в пересчете на кислоту хлорогеновую проводили по спектрофотометрической методике, описанной в литературе [265, 293].2.2.7. Исследование аминокислотного состава ЛРС методом КЭПолный состав АК (свободные и связанные АК) в исследуемом ЛРС исследовали методом КЭ («Капель-105/105М», «Люмэкс», СПб, Россия), для чего точные навески образцов гидролизовали в течение 16-18 часов 6 М соляной кислотой при температуре 110±5 °С [139]. Метод основан на получении фенилизотиокарбамильных производных из свободных АК, последующем их разделении и количественном определении в стандартных рекомендованных условиях анализа [119,120,139,169].2.2.8.
Исследование состава аминокислот изучаемого ЛРС методом ТСХПриготовление извлечения из листьев крапивы двудомной: Около 2,5 г (т.н.) измельченной фракции ЛРС с размером частиц менее 0,5 мм экстрагируют в конической колбе объемом100 мл с 30 мл воды очищенной при нагревании на кипящей водяной бане в течение 30 мин.Затем колбу быстро охлаждают до комнатной температуры. Извлечение процеживают через несколько слоев марли в мерную колбу объемом 25 мл, отжимая ЛРС. Доводят объем раствора,при необходимости, до метки водой очищенной [169,298].Приготовление извлечения из плодов облепихи крушиновидной: Около 10,0 г (т.н.) измельченных плодов облепихи крушиновидной высушенных экстрагируют в конической колбе71объемом 100 мл с 50 мл воды очищенной на кипящей водяной бане с обратным холодильникомв течение 60 мин.
Затем колбу с содержимым быстро охлаждают до комнатной температуры.Извлечение процеживают через несколько слоев марли в мерную колбу объемом 50 мл, отжимая ЛРС. Если необходимо, доводят объем раствора до метки водой очищенной [169,297].2.2.9. Количественное определение дубильных веществ в ЛРС методом перманганатометрии до и после осажденияПолучение извлечения из листьев крапивы двудомной: измельченное ЛРС, проходящеечерез сито с диаметром отверстий 0,5 мм, массой около 1,0 г (т.н.), экстрагируют в коническойколбе объемом 250 мл с 125 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным воздушнымхолодильником в течение 30 мин. Жидкость процеживают через несколько слоев марли в коническую колбу, не дожидаясь охлаждения, избегая попадения частиц ЛРС в колбу.Получение извлечения из плодов облепихи крушиновидной: Около 1,0 г (т.н.) сырья экстрагируют в конической колбе объемом 250 мл с 125 мл нагретой до кипения воды и кипятят собратным воздушным холодильником в течение 30 мин.
Жидкость процеживают через несколько слоев марли в коническую колбу, не дожидаясь охлаждения (охлаждение сопровождается снижением растворимости ДВ в воде), избегая попадения частиц ЛРС в колбу.Отбирают 5 мл полученного извлечения в коническую колбу для титрования вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды, 5 мл индигосульфокислоты и титруют при постоянномперемешивании раствором калия перманганата (0,02 моль/л) от синего до золотисто-желтогоокрашивания. Параллельно проводят контрольный опыт. К 5 мл индигосульфокислоты, прибавляют 105 мл воды и титруют калия перманганатом (0,02 моль/л) до золотисто-желтогоокрашивания.
Содержание суммы дубильных веществ (ДВ) (X1) в процентах в пересчете на абсолютно-сухое сырье вычисляют по формуле 5:Х 1 ,%(Vo Vk ) 0,004157 125 100 100а 5 (100 W )(Vo Vk ) 0,004157 25 100 100a (100 W )(5)Vо и Vк – объем раствора калия перманганта (0,02 моль/л), израсходованного на титрование восновном и контрольном опытах соответственно, в мл; 0,004157 – количество ДВ в пересчетена танин, соответствующее 1 мл раствора калия перманганата (0,02 моль/л), г; а – масса ЛРС, г;W – влажность ЛРС, %;Желатиновый метод. Отбирали 20 мл полученного извлечения, переносили в мернуюколбу объемом 50 мл и добавляют 20 мл 1 % раствора желатина в 10 % растворе натрия хлорида, доводили водой до метки.
Перемешивали и образовавшийся осадок отфильтровывали, отбрасывая первые порции фильтрата. Далее поступали как описано выше в методике перманганатометрического определения. Содержание ДВ, осажденных желатином (X3), в процентах впересчете на абсолютно-сухое сырье вычисляли по формуле 6:72Х3Х1Х2 ,(6)где Х2 – сумма веществ, окисляемых перманганатом калия, после осаждения ДВ желатином[303,332].Х 2 ,%(Vo Vk ) 0,004157 125 50 100 100а 20 5 (100 W )(Vo Vk ) 0,004157 125 50 100a (100 W )(7)2.2.10.
Определение жирорастворимых витаминов в ЛРС методом ТСХПриготовление извлечения из листьев крапивы двудомной: Точную навеску измельченного ЛРС с размером частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5 мм, массойоколо 1 г, экстрагируют в конической колбе объемом 100 мл с 50 мл экстрагента (смесь гексанэтанол (1:1) или н-гексан) при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильникомв течение 45 мин. Затем колбу с содержимым быстро охлаждают до комнатной температуры.Извлечение процеживают через несколько слоев плотной марли, отжимая частицы ЛРС [306].Приготовление извлечения из плодов облепихи крушиновидной: Около10,0 г (т.н.) плодовоблепихи (в пересчете на абсолютно сухое сырье) разминают стеклянной палочкой в конической колбе объемом 50 мл и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником втечение 45 мин с 30 мл этанола.
Затем колбу с содержимым быстро охлаждают до комнатнойтемпературы. Извлечение процеживают через несколько слоев марли, отжимая ЛРС [306].2.2.11. Анализ соединений фенольной фракции изучаемого ЛРС методом ВЭЖХ-ДМД-МССтандарты и растворители. В качестве стандартных образцов использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества: рутин (≥94%, Sigma), гиперозид (≥95%, HWI ANALYTIK GMBH), изокверцитрин (≥94%, HWI ANALYTIK GMBH), кемпферол-3-глюкозид(≥95%, PhytoLab), хлорогеновая кислота (≥95%, Sigma), кофейная кислота (≥98%, Sigma), феруловая кислота (≥99%, Aldrich), розмариновая кислота (>96%, Aldrich), кафтаровая кислота(≥98%, Fluka), п-кумаровая кислота (≥98%, Sigma), синаповая кислота (≥98%, Sigma).
В работебыли использованы следующие растворители/реактивы: вода очищенная (получена с помощьюсистемы MilliQ® Advantage A10), ацетонитрил UPLC/HPLC grade производства AppliChemPanReac (Дармштадт, Германия), метанол UPLC/HPLC grade производства J.T. Baker (AvantorPerformance Materials, Пало Альто, США), муравьиная кислота 98-100% производства Merck(Дармштадт, Германия).Методика эксперимента: около 2,0 г (т.н.) измельченного сырья переносили в круглодонную колбу на 100 мл, добавляли 50 мл 60% метанола.
Экстракцию проводили на водянойбане с обратным холодильником при температуре 95ºС в течение 2 ч. Далее колбу с извлечением охлаждали до комнатной температуры и помещали на ультразвуковую ванну на 5 мин. Содержимое колбы фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл,доводили до метки 60% метанолом, аликвоту в 1,5 мл переносили в центрифужную пробирку и73центрифугировали при 15000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант помещали в виалу для автосемплера.
Исследования проводились с использованием системы ВЭЖХ Agilent 1100 (AgilentTechnologies, США), оснащенной бинарным насосом, дегазатором, термостатируемым автосемплером, термостатом колонок, ДМД спектрофотометрическим (Agilent 1100 Series Diode Array)и времяпролетным (TOF) МС-детектором (Agilent 6200 TOF LC/MS). Идентификацию и определение содержания БАВ проводили по методике, разработанной ранее [117]. Условия ВЭЖХ.Неподвижная фаза: колонка ProteCol C18 HPH125 250×4.6 мм с размером частиц 5μм. Подвижная фаза: А – 0,1% раствор муравьиной кислоты, В – ацетонитрил. Градиентное элюирование 040 мин, 10-60% В, затем регенерация колонки 41-50 мин, 10% В.
Температура колонки 30 ºС,температура автосемплера 20 ºС, скорость подачи элюента 0,5 мл/мин, объем вводимой пробы10 μл. ДМД спектрофотометрическое детектирование проводилось при 5 аналитических длинахволн: 370 нм, 350 нм, 338 нм, 330 нм и 290 нм. Условия масс-детектирования. Ионизация электроспреем, сканирование масс – в режиме регистрации положительных ионов (ESI-MS+) в диапазоне m/z 100-1000 Да. Рабочие параметры источника ионизации: напряжение на капилляре3500 В, поток газа-осушителя (азот) 9 л/мин, температура 325 ºС, давление на распылителе 0,27МПа. Напряжение на фрагменторе 175 В, на конусе – 65 В, на октополе OCT 1RF Vpp – 250 В.Обработка данных осуществлялась с помощью программного обеспечения Agilent MassHunterWorkstation Software.2.3. Определение антиоксидантной активности извлечений из ЛРС и МЭ1. Антиоксидантную активность (АОА) определяли методом перманганатометрического титрования по известной методике Максимовой Т.В.
[196].2. АОА исследуемого ЛРС определяли по методике, основанной на способности ингибироватьаутоокисление адреналина в щелочной среде in vitro, представленной в литературе [165,171,267]. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-2000-01 (Россия) в кюветах с толщиной слоя 10мм.2.4. Исследование экотоксикантов в изучаемых образцах1. Приготовление счетных образцов для радиационного контроля осуществлялось с концентрированием удельной активности по стандартной методике [23,189].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
