Диссертация (1139719), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Свежеприготовленныйполученный раствор в количестве 3 мкл наносили на стартовую линию хроматографическойпластинки марки «Sorbfil» или «Плазмохром» размером 10×15 см с полимерной подложкой.Пластинку сушили на воздухе, а хроматографировали восходящим способом. После достижения элюентом линии фронта, пластинку вынимали и высушивали на воздухе, а затем детектировали 10 % спиртовым раствором ФМК и термостатирования при tº = 100 – 120ºС [365,366].2.13. Статистическая обработка данных и валидация методикСтатистическую обработку результатов проводили по программе «Statistica - 7.0» и методике ОФС ГФ XIII изд.
[93]. Градуировочные графики строились по методу наименьшихквадратов.Разработанные методики валидировали согласно ОФС ГФ XIII изд. «Валидация фармакопейных методик» (ОФС.1.1.0012.15) [93].82ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К ОПРЕДЕЛЕНИЮОСНОВНЫХ ГРУПП БАВ ЛРС И МАСЛЯНЫХ ЭКСТРАКТОВ МЕТОДОМ ТСХИзучение возможности теоретического подхода к выбору оптимальных условийхроматографирования различных групп БАВ липофильной и гидрофильной природы, позволяющих провести их разделение, идентификацию и количественное определение методом ТСХявляется актуальным и мало разработанным направлением хроматографии в целом.
Выбор ТСХобусловлен всеми преимущества, характерными для хроматографических методов в сочетаниис высокой экономической доступностью, простотой и экспрессностью выполнения анализа.Анализ научной литературы за последние 30 лет продемонстрировал, что при контролекачества ЛП, содержащих БАВ природного происхождения, предпочтение отдано физикохимическим методам, являющихся наиболее чувствительными, экспрессными и информативными. Более достоверный качественный и количественный анализ возможно получить с помощью хроматографических методов, из которых наибольшее распространение получили ТСХ[35,120,132] и ВЭЖХ [16,103,104,117,134,175,212].
Уже достаточно давно появились первыепубликации, свидетельствующие о возможности количественного анализа данных ТСХ с применениемспециализированногооборудованияилипрограммногообеспечения[13,35,40,105,106,135,270,375]. ТСХ достаточно экономичен, чувствителен, не требует сложного оборудования, а поэтому доступен. Время анализа с его использованием сокращается в несколько раз по сравнению с хроматографией на бумаге и колоночной хроматографией. Поэтомуразработка новых простых, экспрессных, доступных и воспроизводимых методик анализа БАВявляется актуальной задачей и вызывает научный интерес.3.1.
Исследование хроматографических характеристик липофильных БАВ в тонком слоесорбентаНа процесс хроматографирования в ТСХ существенным образом влияют сорбент, растворитель, условия анализа и некоторые другие факторы [39, 266]. Поэтому целью исследований, описанных в данной Главе, явилось изучение различных элюирующих систем ивозможности теоретического подхода к выбору оптимальных условий хроматографирования различных групп БАВ, позволяющих провести их разделение, идентификацию и количественное определение методом ТСХ.833.1.1.
Изучение закономерностей хроматографического поведения β-каротинаДля выбора детектирующего реагента были исследованы различные реактивы, предложенные в литературе [32,132,374], а также подобранные самостоятельно. При использовании вкачестве обнаруживающих реагентов концентрированных минеральных кислот [132] на хроматограммах на белом фоне появлялось темно-синее быстроисчезающее окрашивание. Установлено, что 5 % спиртовый раствор ФМК и 10 % спиртовый раствор ФМК с добавлением концентрированной хлороводородной кислоты (25:1) [132] не обладали достаточной чувствительностью.
Идентификацию зон β-каротина на хроматограммах можно проводить визуально, безприменения детектирующих реагентов в виду того, что данное БАВ окрашено в яркий желтооранжевый цвет [32].В настоящее время очень велико колличество растворителей, отличающихся по силе ипо селективности [39,266]. Изучены элюенты для определения β-каротина в тонком слое сорбента, предложенные в литературе [32, 132,374], а также новые хроматографические системы(таблица 36), суммарная полярность (Р) которых, примерно соответствовала рекомендованной влитературе [32,132,374].В описанных в таблице 36 элюентах, осуществляли хроматографирование стандартногораствора β-каротина (ВФС 42-0008018000) [32].
Для каждой подвижной фазы рассчитывали величину полярности элюента (Р) [266]; величины Rf β-каротина; высоты, эквивалентных теоретических тарелок (Н); а, также их число (N). Результаты представлены в таблица 36.Таблица 36Эффективность определения β-каротина в различных элюирующих системах(n = 3) методом ТСХ№ЭлюентРRfН, ммNп/п1Г00,193±0,010,94093,622Б3,000,970±0,010,347221,763Г – Б (1:1)1,500,950±0,011,51355,544Г – Б (5:1)0,500,980±0,010,410214,605Г – Б (9:1)0,300,740±0,020,280275,006Г – Б (14:1)0,200,690±0,020,430193,027Г – Б (19:1)0,150,575±0,010,783102,178Г – Б (29:1)0,100,376±0,010,780108,979Х4,400,980±0,010,950103,2010Г – Х (3:1)1,100,980±0,010,740118,9211Г – Х (2:1)1,470,980±0,011,15076,5012Б – А (25:1)3,090,980±0,010,760115,50Г – Б – гексан-бензол; Г – Х – гексан-хлороформ; Г – гексан; Б – бензол; Х – хлороформ; А - ацетон84Варьируя содержанием бензола и гексана в бикомпонентной системе растворителей, получены экспериментально кривые зависимости величины Rf от объемной доли каждого компонента в элюенте (рис.
7). С помощью данных зависимостей установлено, что достижение оптимальной величины Rf [39] возможно при cодержании в системе бензола и гексана от 3,3 до 6,0 иот 94 до 96,7 об. % соответственно. Для практической ТСХ, как известно, оптимальным считается интервал значений Rf от 0,3 до 0,6. Данные таблицы 36 показывают, что величина Rf βкаротина, близкая к оптимальной, получена в системах № 5 - 8; N и Н – в системах № 2, 4 - 6.Следовательно, хроматографический процесс эффективен при использовании данных элюентов.Однако, только в системах № 5 – 8 зоны β-каротина имели правильную округлую форму,что соответствует линейной изотерме сорбции БАВ в данных условиях.
В результате, по совокупности представленных параметров и качеству хроматографической картины разделения дляопределения β-каротина в тонком слое сорбента была выбрана система № 9. Детальный анализвлияния полярности хроматографической системы в диапазоне от 0 до 0,5 ед. на величину Rf ,позволил установит интервал значений Р элюента, в котором данная зависимость принимаетлинейный вид (от 0 до 0,2 ед.
полярности системы) (рис. 8).1Величина R f0,8ГексанБензол0,60,40,20020406080100Содержание компонента в п. ф., % (по объему)Рис. 7. Графическое отображение зависимости величины Rf β-каротина от объемной доли компонентов в подвижной фазе (сорбент – силикагель)С помощью выявленной зависимости возможно конструировать различные системы дляидентификации β-каротина, чтобы величина Rf соответствовала оптимальным рекомендуемымзначения [39]. Таким образом, диапазон полярностей возможных элюентов может вариабилен винтервале от 0,05 до 0,168.85Rf0,80,70,60,50,40,30,20,10y = 2,5383x + 0,1729R² = 0,975600,050,10,15Полярность элюента0,20,25Рис.
8. Вид зависимости Rf β-каротина от полярности системыВ целом, по совокупности полученных результатов подобраны оптимальные условияхроматографического определения β-каротина и показана возможность теоретического подходак выбору условий его идентификации в тонком слое сорбента: пластинки хроматографическиесиликагелевые марки «Sorbfil» (тип «А») размером 5×10 см с полимерной или алюминиевой подложкой; объем наносимой пробы: 10 мкл 0,1% спиртового раствора β-каротина; элюент: гексан– бензол (29:1); детекция зон в видимом свете; время насыщения камеры парами элюента: 15 –20 мин; время развития хроматограммы: 30 мин.
Предел обнаружения β-каротина с помощьюпредложенной методики составил – 10 мкг в зоне.3.1.2. Изучение закономерностей хроматографического поведения эргокальциферолаДля обнаружения пятен эргокальциферола были использованы реагенты: 5 % спиртовыйраствор ФМК и 70 % раствор хлорной кислоты, как наиболее часто рекомендуемые в научной литературе [132,152,353,374]. Применение кислоты хлорной в качестве детектирующего реагента сочтенонецелесообразным ввиду его высокой токсичности, а также получения размытых хроматографическихзон на пластинке. Опытным путем определено, что предел обнаружения эргокальциферола с помощью ФМК по разработанной методике ТСХ составил 7 ·10-9 г, что сопоставимо по чувствительности сопределением витамина D2 методом ВЭЖХ [227].Изучено порядка пятнадцати подвижных фаз в широком интервале значений полярности(таблица 37), предложенных для этих целей в литературе [132,152,374], а также подобранные самостоятельно.
В описанных в таблице 37 элюентах, осуществляли хроматографирование стандартного раствора эргокальциферола (ФСП 42-0008018000) [355]. Хроматографические параметрывитамина D2 в различных элюирующих системах приведены в таблице 37. При использованиисистем № 4, 6 и 11 достигнуты, согласно автору [39], оптимальные величины Rf .При изменении соотношений хлороформа и гексана в бикомпонентной подвижной фазеполучены графические зависимости Rf от объемной доли каждого компонента в элюенте (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
