Диссертация (1139719), страница 23
Текст из файла (страница 23)
22). Для количественной интепретации данных хроматограмм методом компьютерного сканирования целесообразно применять систему № 7, так как в данном элюенте зоны рутина были округлой формы, что свидетельствует о линейной изотерме сорбции.1y = 0,4762x - 2,1095R² = 0,974Величина Rf0,80,60,40,202468Полярность (Р) системыРис. 21. Вид зависимости значения величины R рутина от Р элюента103Рис. 22.
Калибровочная хроматограмма с серией стандартных раствороврутина (с = 0,05 – 2 %): 1 – 0,05 %; 2 – 0,1 %; 3 – 0,25 %; 4 – 0,5 %; 5 – 0,75 %; 6 – 1 %; 7 – 1,5 %; 8–2%По совокупности экспериментальных данных были предложены и теоретически обоснованыоптимальные условия определения рутина методом ТСХ: неподвижная фаза – пластинки силикагелевые марки «Sorbfil» 5х10 см ПТСХ-П-А-УФ; оптимальный объем пробы – 3 мкл 2 мг/мл спиртового раствора рутина; подвижная фаза – этилацетат-ледяная уксусная кислота-вода(7,5:1,5:1,5); проявитель – 10 % спиртовый раствор NaOH; насыщение камеры парами элюента– 20 мин; время развития хроматограмм – 35 мин; время термостатирования при t º ≥ 80 ºС – 3-5мин; предел обнаруения – 0,5 мкг в зоне.В вышеописанных условиях проведения ТСХ-анализа были получены хроматограммы ссерией стандартных растворов рутина (рис.
22). Хроматографические зоны на пластинах проявляюти сразу же сканируют на планшетном сканере с разрешением не менее 300 dpi, а полученные изображенияобработывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer» [137,200]. Вид треков в координатах Rf –интенсивность представлен на рис. 23.Рис. 23. Денситограмма 0,5 % стандартного раствора рутинаПолученные результаты свидетельствуют о том, что наблюдается нелинейная зависимость площади хроматографической зоны рутина от концентрации стандартного раствора сточкой перегиба 0,5 % (рис. 24).104Площадь хроматографическойзоны, мм кв.1000900800700y = 274,68x + 345,68R² = 0,9804600500400300200100y = 995,12x - 43,571R² = 0,9855000,511,52Концентрация стандартного растворарутина, %2,5Рис. 24.
Зависимость площади хроматографической зоны от концентрации стандартного раствора рутинаАнализ полученных данных позволил установить линейную зависимость между содержанием рутина и интенсивностью окраски хроматографической зоны в диапазоне изучаемыхконцентраций (0,05 – 0,5 и 0,5 – 2,0 %). Наличие точки перегиба объясняется снижением коэффициента инструментальной чувствительности определения («а» в уравнении у = ах + b) с увеличением концентрации. Поэтому ошибка в определении концентрации рутина будет уменьшаться с увеличением «а», следовательно, применение градуировочного графика для определения содержания рутина в области низких концентраций, где а = 995,12 (рис. 24) приводит к более точным результатам по сравнению с результатами, полученными по графику, представленному на рис.
24, где а = 274,68. Наличие в регрессионном уравнении коэффициентов b, отличных от нуля и равных 43,571 и 345,68 говорит о постоянной систематической ошибке, обусловленной влиянием яркости фона пластины на оценку яркости окрашенной хроматографическойзоны при обработке хроматограммы компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer».3.2.2. Количественное определение аскорбиновой кислоты методом ТСХИспользование метода ТСХ в анализе ЛРС ограничивается, в основном, только установлением качественного состава ОК [2,19,111]. В связи с вышесказанным, актуальным представляется разработка методики идентификации и количественного определения аскорбиновойкислоты (АсК) методом высокоэффективной хроматографии в тонком слое сорбента.105На первом этапе работы были экспериментально выбраны и теоретически обоснованыоптимальные условия хроматографирования АсК методом ВЭТСХ.
В эксперименте изученошестнадцать типов элюирующих систем с различными значениями полярности (таблица 52).Таблица 52Параметры эффективности определения АсК в различных системах для ТСХ№п/п1Подвижная фазаРRfН, ммNX4,400,0l±0,00l0-2Бн3,000,0l±0,00l03ЭЭ-Г (l:l)l,450,0l±0,00l04Б-МК-В (25:2,5:29,7)6,700,66±0,0l0,463l77,l15Б-МК-В (5:0,5:2)5,470,63±0,0l0,48ll72,566БУВ (4:l:5)6,680,57±0,020,532l54,l47Эт-конц. раствор аммиака (16:4,5)0,69±0,0l0,l80400,008н-пропанол-раствор аммиака (6:4)0,92±0,02l,19l62,l39Э-МК-В (3:l:l)5,780,63±0,0l0,l80438,8910Э-У-МК-В (l00:l1:1l:25)5,440,67±0,0l0,29l28l,7911Э-У (80:20)4,680,54±0,0l0,356247,l912Э-У (85:l5)4,590,42±0,0l0,l03767,0013Э-У (90:l0)4,490,37±0,0l0,l25664,0014Э-У (95:5)4,400,26±0,0l0,l67520,9615А-М-У (3:l:l)5,800,53±0,0l0,203443,3516А-Т-МК (6:3:l)4,630,99±0,0l0,522l72,4lЭ – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; М - метанол; Х – хлороформ; Г – гексан; Б – бутанол; Т – толуол; Бн – бензол; Эт – этанол; А – ацетон; МК – муравьиная кислота;ЭЭ - этиловый эфирКак видно из данных таблица 52 и рис.
25 для достижения оптимальных величин Rfнеобходимо использовать элюенты со значениями полярности в интервале 4,2–5,0 ед. [266].Величина Rf0,80,60,40,200246Полярность (Р) системыРис. 25. Вид зависимости величины Rf АсК от полярности элюентаПри более подробном исследовании влияния Р системы на величину Rf АсК был определен интервал значений Р элюента, в котором данная зависимость приобретает линейный характер (от 4,0 до 4,7 ед. полярности (рис. 26).106С помощью установленной зависимости возможно подбирать различные системы дляопределения витамина С методом ТСХ так, чтобы величина Rf соответствовала оптимальнымрекомендованным в литературе [39] значениям. Таким образом, интервал Р элюента может варьировать в достаточно узком диапазоне от 4,40 до 4,80 ед.0,6y = 0,7524x - 3,0127R² = 0,985Величина Rf0,50,40,30,20,103,94,14,34,54,7Полярность (Р) системыРис.
26. Вид линейной зависимости величины Rf АсК от значения Р элюентаВыбор проявителя (таблица 53) для визуальной оценки хроматографических зон осуществляли с учетом достаточной специфичности, чувствительности, экономической доступности, высокого качества получаемой картины, а также контрастности хроматографических зон и фона, чтоможет позволить проводить дальнейший количественный анализ с применением сканирующихустройств.
В качестве проявителя, были выбраны два реагента: 5 % спиртовый раствор ФМК и 0,2%спиртовый раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Пределы обнаружения пятен АсК с помощью выбранных реагентов приведены в таблица 53.Для каждой подвижной фазы на хроматограммах были рассчитаны также параметрыэффективности хроматографирования, такие как высота (H) и число теоретических тарелок (N)[39]. Данные таблицы 52 показывают, что согласно значениям величин N и Н, наибольшая эффективность хроматографического процесса наблюдалась в системах № 7, 9, 12-15, а наименьшая - в системе № 8. Системы № 1-3 являются неэффективными.В системах № 6, 11-15 достигнуты оптимальные величины Rf .
Элюирование можно проводить в системах № 12-15. Системы № 12-14 предлагаются впервые. Лучшие значения Rf, Н, N,а также качество хроматографических зон было достигнуто в системе № 12 (таблица 52). Для количественной оценки данных хроматограмм методом компьютерного сканирования целесообразно применять систему № 12.Таким образом, по совокупности экспериментально полученных результатов были выбраны итеоретически обоснованы оптимальные условия определения АсК в тонком слое: неподвижная фаза– пластинки силикагелевые марки «Sorbfil» размером 5х10 см с алюминиевой ПТСХ-А-А или полимерной подложками ПТСХ-П-В; элюент – этилацетат-ледяная уксусная кислота (85:15); воз-107можные проявители – 5 % спиртовый раствор ФМК или 0,2% спиртовый раствор 2,6дихлорфенол-индофенолята натрия; объем наносимой пробы – 2 мкл 2 мг/мл спиртового раствора АсК; время насыщения камеры парами элюента – 20 мин; время развития хроматограмм –35 мин; время термостатирования после проявления при t º ≥ 80 ºС – 3-5 минут.Таблица 53Основные детектирующие реагенты, использованные для идентификации зон АсК на хроматограммах [203]№п/пДетектирующийреагент15 % спиртовыйраствор ФМК2Уф-свет (254 нм)34560,2% спиртовыйраствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия0,2% спиртовыйраствор бромкрезолового зеленого0,2% спиртовыйраствор бромфенолового синего0,01 М раствор нитрата серебраОкрашиваниеПредел опрехроматографических зон деления, гСинее на желто-зеленомфонеЯрко-малиновое свечение на белом фонеСпецифичность4·10-7-4·10-7-Белое на розовом фоне2·10-6+Не проявляет--Не проявляет--Темно-серое на беломфоне1·10-6-Сразу же после проявления хроматографических зон, пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (рис.
27 а и б) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». Установлены линейные зависимости между содержанием АсК и площадью хроматографической зоны (рис. 28 а и б) в диапазоне изучаемых концентраций.Использование двух калибровочных кривых позволяет значительно расширить областьприменения разработанной методики. Калибровочная хроматограмма с серией стандартныхрастворов АсК и построенный на ее основе график зависимости площади зоны (S) от концентрации вещества в пробе (рис. 28 б) при использовании в качестве проявителя 5% раствораФМК может использоваться в контроле качества субстанции и монокомпонентных лекарственных форм витамина С. Данный реагент не является специфическим для АсК и на хроматограммах проявляет и другие зоны сопутствующих веществ, что снижает качество картины разделения и затрудняет обработку полученных изображений.Однако, ввиду большей чувствительности ФМК (таблица 53), возможно определять количественное содержание витамина С в образцах с низким его содержанием или работать с более разбавленными растворами, исключая процедуру концентрирования растворов.10812 3 45 6 71 2 3 4 5 6 7абРис.
27. Вид хроматограмм с серией стандартных растворов АсК: а - (0,15 – 0,45%) (детектирующий реагент - 0,2% спиртовый раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия): 1 – 3 мкг; 2 – 4мкг; 3 –5 мкг; 4 – 6 мкг; 5 – 7 мкг; 6 – 8 мкг; 7 – 9 мкг.б - (0,05 – 0,40%) (детектирующий реагент - 5 % спиртовый раствор ФМК): 1 – 1 мкг; 2 – 2 мкг; 3–3 мкг; 4 – 4 мкг; 5 – 5 мкг; 6 – 6 мкг; 7 – 8 мкгS, мм85000y = 9233,6x - 1550,1R² = 0,994180000y = 12467x + 5460,2R² = 0,9963S, мм7500065000600005500045000400003500025000200002468Содержание аскорбиновой кислоты в пробе, мкг10150000246Содержание аскорбиновой кислоты в пробе, мкгабРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
