Диссертация (1139719), страница 26
Текст из файла (страница 26)
При необходимости доводят объем до метки экстрагентом.Полученную суммарную вытяжку в количестве 5 или 10 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способана пластинах размером 10×15 см. Высота пробега элюента не менее 13 см. Вид хроматограмм представленна рис. 39.Результаты количественного определения глутаминовой кислоты в извлечении из листьев крапивы двудомной и облепихи крушиновидной представлены в табл.
64.Таблица 64Результаты количественного определения глутаминовой кислоты в ЛРС (в пересчете на абсолютно сухое сырье)[204]№ п/пЛРСНайдено глутаминовой кислоты, %12Листья крапивы двудомнойПлоды облепихи крушиновидной0,0110±0,00120,3299±0,0360Статистическая обработка данных, полученных по предложенной методики на примереплодов облепихи крушиновидной представлена в таблице 65.12Рис. 39. Вид хроматограммы извлечения: 1 - из листьев крапивы двудомной (трек 1 и 2 – 10 мклизвлечения); 2 - из плодов облепихи крушиновидной (5 мкл извлечения)121Таблица 65Метрологическая характеристика методики количественного определения глутаминовой кислоты (P = 95 %, n=3)xсрS2SSxcpxср±∆xcp∆xcpεср, %0,0110 0,000000230,00048 0,00028 0,0110±0,0012 0,0012 10,91Разработана методика количественного определения АК (на примере глутаминовой кислоты) методом ВЭТСХ.
С помощью разработанной методики определено содержание глутаминовой кислоты в сумме свободных АК в извлечениях из изучаемого ЛРС [204].3.2.4. Количественное определение полифенольных соединений методом ступенчатогоэлюирования в тонком слое сорбентаМногие из описанных в литературе способов позволяют определять только суммарноесодержание дубильных веществ, без достоверной информации о присутствии отдельных компонентов. Описан способ идентификации и количественного денситометрического определения галловой кислоты методом ТСХ в траве лофанта анисового [372]. Недостатком данногоспособа является невозможность одновременного определения танина, галловой кислоты икверцетина в растительных объектах и многокомпонентных лекарственных формах без предварительного разделения на отдельные компоненты.
Известны способы разделения и идентификации ДВ методом ТСХ в извлечениях из растительного сырья [97]. Данные способы не лишены недостатков, так как не позволяют проводить количественное определение полифенольныхсоединений в исследуемых объектах. Способов, позволяющих идентифицировать и количественно определить не только ДВ, но и представителя флавоноидной группы полифенольныхсоединений – кверцетина методом ТСХ, в научной литературе не обнаружено. Следовательно,актуальной является разработка способа разделения и количественного определения полифенольных соединений (на примере танина, галловой кислоты и кверцетина) методом элюирования в тонком слое сорбента.Для визуальной оценки зон хроматографические пластины после элюирования осуществляли отбор проявителей, с учетом (таблица 66) специфичности, чувствительности, доступности и высокогокачества получаемой картины.
В качестве проявителя, был выбран реагент - 1 % спиртовый растворжелезо-аммонийных квасцов (ЖАК) (таблица 66). Пределы обнаружения пятен БАВ с помощьювыбранного реагента и специфичность приведены в таблице 67.Для выбора оптимальных условий хроматографического определения полифенольныхБАВ было изучено влияние полярности элюентов на хроматографическую подвижность в тонком слое (рис. 40). В эксперименте изучены элюирующие системы с различными значениями122полярности, предлагаемые в литературе [97,323,372], а также вновь апробированные элюенты(таблица 68).Таблица 66Детектирующие реагенты, использованные для определения полифенольных соединений в тонком слое сорбента№п/пОткрывающийреагент1Окрашивание хроматографических зонГалловая кислотаТанин5 % спиртовыйраствор ФМКСинее на желтозеленом фоне-2Уф-свет (254 нм)Ярко-малиновое свечение на белом фоне-3Уф-свет (365 нм)Бурое на розовомфоне-41 % спиртовый растворЖАКСине-фиолетовое набелом фонеСине-сероена беломфоне55% спиртовый растворNaOHЖелто-оранжевое набелом фоне-5% спиртовый растворAlCl32% раствор ванилина всоляной кислотеФиолетовое на беломфоне---67КверцетинЖелто-бурое нажелто-зеленомфонеЯрко-малиновоесвечение на беломфонеБурое на розовомфонеЗеленовато-желтоена беломОранжевокоричневое на белом фонеЖелтое на беломфонеЖелтое на беломфонеТаблица 67Пределы обнаружения БАВ с использованием 1 % спиртовый раствор ЖАК№ДетектирующийПредел обнаружения, г в зонеп/преагент1Галловая кислота3·10-72танин5,5·10-73кверцетин1·10-6Таблица 68Хроматографическая подвижность полифенольных БАВ в различных подвижных фазах [323]Rf±0,02№Подвижная фазаРГалловая кисп/пТанинКверцетинлота1234561Б-У-В (l0:з:7)0,7760,2590,6486,032345678Б-У-В (4:l:2)Б-У-В (4:l:l)Э-У-В (5:l:l)Б-МК-В (65:l6:l9)МК-В-ЭФ (l0:l0:80)Э-МК-В (84:8:8)Э-МК-В (80:l0:l0)0,8660,9l00,9650,9l30,9740,9660,9640,2050,0650,0590,7l60,96l0,2470,9640,6l50,6200,4940,6400,7400,2580,3865,695,l35,245,374,895,04123123459Э-МК-У-В (67:7,5:7,5:l8)0,9730,9070,84210ЭЭ-У-Г-Э (20:20:20:40)0,8300,l500,07511X-В-Эт (60:30:20)0,95l0,0250,07412Э-У-В (7,5:l,5:l,5)0,9750,0490,3l513Э-МК-В (7,5:l,5:l,5)0,9870,9620,68514Б-МК-В (10:з:7)0,8400,7330,57315Б-МК-В (4:l:2)0,7690,64l0,5l316Б-МК-В (4:l:l)0,8460,7050,6l517Э-МК-В (5:l:l)0,9740,9740,82l18ЭЭ-МК-Г-Э (20:20:20:40)0,9500,8230,468Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; Х – хлороформ; Г – гексан; Бнол; Эт – этанол; МК – муравьиная кислота; ЭЭ - этиловый эфир; ЭФ - этилформиат69,683,545,805,245,366,l55,805,275,363,70– бута-Рис.
40. Вид зависимости величины Rf полифенольных БАВ от полярности элюентаКак видно из данных таблицы 68 и рис. 40 для достижения оптимальных величин Rf, атакже четкого разделения исследуемых БАВ на хроматограммах необходимо использоватьэлюенты со значениями полярности в интервале 4,0–6,0 ед. Однако, данные рис.
40 также показывают, что за одно хроматогрфирование возможно отделить галловую кислоту, тогда как танин и кверцетин имеют в данном диапазоне полярностей имеют сходные значения величин относительной подвижности в тонком слое.В то же время при достижении величины полярности элюента 8,0-9,5 ед. наблюдаетсяудовлетворительное разделение зон танина и кверцетина на хроматограммах.
Следовательно,для количественной обработки хроматограмм методом компьютерного сканирования необходимо использовать фронтальное элюирование, где первый элюент – система №10 (Р=3,54 ед.) свысотой пробега 8-9 см, а второй элюент - система №9 (Р=9,68 ед.) с высотой пробега 7 см.Таким образом, по совокупности полученных результатов были выбраны и теоретическиобоснованы оптимальные условия определения полифенольных БАВ в тонком слое сорбента: неподвижная фаза – силикагелевые пластинки марок «Sorbfil» 5х10 см с алюминиевой ПТСХ-А-А;124элюент 1 (высота пробега 9 см) – диэтиловый эфир-уксусная кислота-гексан-этилацетат(20:20:20:40); элюент 2 (высота пробега 7 см) – этилацетат-муравьиная кислота-уксусная кислота-вода (67:7,5:7,5:l8); детектирующий реагент – 1 % спиртовый раствор ЖАК; оптимальныйобъем пробы – по 2 мкл 0,5% спиртовых растворов галловой кислоты и танина и 0,1% спиртового раствора кверцетина; время выдерживания пластинки в термостате после проявления при tº ≥ 80 ºС – 3-5 минут.Сразу же после проявления зон на калибровочных хроматограммах, пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (рис.
41) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer». В результате получают треки в координатах Rf –интенсивность (рис. 42).123 4567Рис. 41. Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов БАВ в диапазоне концентраций от 1,0 до 4,0 мкг/мкл: 1 – 1 мкг; 2 – 1,5 мкг; 3 –2 мкг; 4 – 2,5 мкг; 5 – 3 мкг; 6 – 3,5мкг; 7 – 4 мкгУстановлены линейные зависимости между содержанием изучаемых БАВ и площадьюхроматографической зоны (рис.
43 а, б и в) в диапазоне изучаемых концентраций. Полученныерезультаты свидетельствуют о том, что для танина и галловой кислоты наблюдаются нелинейные зависимости площади хроматографической зоны от концентрации стандартного раствора сточками перегиба при 4,5 и 1,5 мкг/мкл соответственно (рис. 43 а и в). Наличие точки перегибаобъясняется снижением коэффициента инструментальной чувствительности определения («а» вуравнении у=ах+b) с увеличением концентрации раствора. Анализ полученных данных позволил установить линейные зависимости между содержанием танина и галловой кислоты и интенсивностью окраски хроматографической зоны в диапазонах изучаемых концентраций (0,5 –4,5 и 5,0 – 7,0 мкг/мкл) и (0,3 – 1,5 и 1,5 – 4,0 мкг/мкл) соответственно.125Рис.
42. Денситограмма смеси стандартных растворов исследуемых БАВПлощадь хроматографической зоны, мм кв.y = 6,0083x + 0,1537R² = 0,953140353025y = 4,4805x + 0,7287R² = 0,9721201510500246Содержание танина в пробе, мкгПлощадь хроматографической зоны, мм кв.304525y = 3,6734x + 1,1792R² = 0,9916201510500123456Содержание кверцетина в пробе, мкгабПлощадь хроматографической зоны, ммкв.35y = 4,8778x + 13,128R² = 0,91543025201510y = 16,601x - 5,3268R² = 0,966500123Содержание галловой кислоты в пробе, мкг4вРис. 43 а.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
