Диссертация (1139719), страница 28
Текст из файла (страница 28)
47).Полученные зависимости также позволили установить соотношения н-бутанола, уксусной кислоты и воды в системе, необходимые для достижения оптимальной величины Rf каждого моносахарида при разделении сложных смесей. Результаты представлены в таблице 74.131Таблица 73Характеристики линейных зависимостей значения подвижности моносахаридов от полярностиэлюента в тонком слое сорбента№МоносахаПараметры линейностип/придУравнениеДиапазон лиКоэффи- Диапазон полярностипрямойнейной завициентэлюента для получеy = ax+bсимости, ед.корреляния оптимальных веполярностиции (R2)личин Rf1Глюкозаy = 0,2321x –5,13 – 6,330,96164,65 – 5,940,77892y = 0,075x +4,42 – 5,220,97272,12 – 6,12Ксилоза0,14093y = 0,4367x –3,54 – 4,640,99373,83 – 4,52Рамноза1,3736110,9Глюкоза0,90,8Ксилоза0,8Рамноза0,7Величина RfВеличина Rf0,70,60,50,40,30,6Глюкоза0,5Ксилоза0,4Рамноза0,30,20,20,10,100020406080Содержание н-бутанола в элюенте(% по объему)100020406080100Содержание ледяной уксуснойкислоты в элюенте (% по объему)Рис.
47. Зависимость величины Rf моносахаридов от содержания компонентов в подвижной фазе (сорбент – силикагель)Однако, при совместном определении большого количества веществ, определяющее значение в хроматографии имеет значение параметра селективности сорбции (L) (таблица 75).Установлено, что наилучшее разделение хроматографических зон моносахаридов достигается всистемах (таблица 72) БУВ при соотношении компонентов 4:1:1; 4:1:2; 9:1:1 и 12:1:1.Таблица 74Оптимальное соотношение н-бутанола, ледяной уксусной кислоты и воды в трехкомпонентнойподвижной фазе при разделении моносахаридов методом ТСХ№ п/пМоносахаридСодержание компонентов в элюенте, %(по объему)БУВ1Глюкоза40-867-307-302Ксилоза50-1000-250-253Рамноза67-1000-200-20У – ледяная уксусная кислота; В – вода; Б – бутанол132В то же время, с точки зрения эффективности хроматографического процесса, характеризующейся величинами высоты, эквивалентной теоретической тарелке (Н, мм) и числом теоретических тарелок (N), наилучшей, для разделяемых веществ, являются системы БУВ при соотношении компонентов 4:1:1 и 4:1:2 (таблица 76).Таблица 75Параметры хроматографического разделения смеси стандартных образцов исследуемых моносахаридовМоносахаридЭффективность разделения в№ п/пГлюкозаКсилозаРамнозасистемеKLKLKL12,46l,2l0,82Б-У-В (4:l:2)2,03l,482l,630,920,68Б-У-В (4:l:l)l,771,353Б-У-В (7:l:l)2,04l,39l,47l,06l,394Б-У-В (6:l:l)2,00l,18l,690,95l,245Б-У-В (5:l:l)l,77l,18l,500,89l,336l,87l,050,77Б-У-В (9:l:l)1,781,3672,08l,130,77Б-У-В (l2:l:l)1,841,47У – ледяная уксусная кислота; В – вода; Б – бутанолХроматографирование можно проводить в этих системах.
Лучшее значение Rf и качествохроматографических зон было достигнуто в системе БУВ 4:1:2 (рис. 48). В данном элюенте зоныстандартных образцов моносахаридов имели округлую форму, что свидетельствует о линейной изотерме сорбции. Для количественной обработки хроматограмм методом компьютерного сканирования целесообразно применять систему данную систему.№п/п123Таблица 76Параметры эффективности хроматографирования исследуемых моносахаридовЭффективность разделения в системеМоносахарид Б-У-В (4:1:2) Б-У-В (4:1:1) Б-У-В (9:1:1)Б-У-В (12:1:1)HNHNHNHNГлюкоза0,70127,14 0,48 183,33 1,6352,151,7550,29Ксилоза0,42211,90 0,36 244,44 1,6053,131,5656,41Рамноза0,35254,29 0,32 275,00 1,0481,731,0782,24Таким образом, по совокупности полученных результатов были выбраны и теоретическиобоснованы оптимальные условия хроматографирования моносахаридов в тонком слое сорбента:сорбент – силикагелевые пластинки марки «Sorbfil» 10х15 см марки ПТСХ-АФ-А; элюент – Б-У-В4:1:2; проявитель – реактив, состоящий из сульфаниламида и о-фталевой кислоты; объем пробы– 2 мкл водного раствора с содержанием моносахаридов 10 мг/мл; время насыщения камерыпарами элюента – 10 мин; время элюирования – 7 часов; время выдерживания пластинки в термостате при t º ≥ 100 ºС – 3-5 мин; чувствительность определения 2,5 - 5·10-6 г моносахарида впробе, нанесенной на пластинку.133123456Рис.
48. Калибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов моносахаридовв диапазоне концентраций от 10 до 35 мкг/мкл: 1 – 10 мкг; 2 – 15 мкг; 3 –20 мкг; 4 – 25 мкг; 5 –30 мкг; 6 – 35 мкгСразу же после проявления хроматографических зон, пластины сканируют с помощью планшетного сканера (разрешение не менее 300 dpi), а полученные изображения (рис. 48) обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer» (Россия). В результате получают треки в координатах Rf – интенсивность (рис. 49). Установлены линейные зависимости между содержанием моносахаридов иплощадью хроматографической зоны (рис.
50 а и б) в диапазоне изучаемых концентраций.Рис. 49. Денситограмма смеси стандартных растворов исследуемых моносахаридов134ГлюкозаКсилозаРамнозаПлощадь хроматографической зоны, мм кв.435385y = 16,327x - 158,66R² = 0,9947335285235185y = 3,7854x + 23,337R² = 0,9744135y = 3,3692x + 8,744R² = 0,97348535810,51315,51820,52325,52830,53335,538Содержание моносахарида в пробе, мкгРис. 50. Градуировочный график для определения содержания глюкозы в области концентраций (15 – 35 мкг/мкл); ксилозы в области концентраций (15 - 30 мкг/мкл); содержания рамнозыв области концентраций (10 – 30 мкг/мкл)Предлагаемый способ был апробирован на изучаемом ЛРС.
Для определения свободныхи связанных простых сахаров извлечение из исследуемых объектов получали путем экстракциисырья водой очищенной с добавлением концентрированной кислоты хлороводородной в соотношении 10:1 при нагревании на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Полученную суммарную вытяжку хроматографировали восходящим способом в условиях предлагаемого способа.На хроматограммах извлечений из исследуемого сырья обнаружены зоны простых сахаров характерной окраски, среди которых идентифицированы глюкоза, ксилоза и рамноза по характерному значению величин Rf в сравнении с достоверными стандартными образцами. Пластины сканировали, а полученные изображения обрабатывают компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer» (рис.
51). Результаты количественного определения моносахаридов в извлечениях из изучаемого ЛРС, атакже метрологическая характеристика полученных результатов представлены в табл. 77.Таблица 77Результаты идентификации и количественного определения моносахаридов в ЛРС (в пересчете на абсолютносухое сырье)№п/пЛРС121Листья крапивыдвудомнойЛистья крапивыдвудомнойМетодика ТСХRf±0,023К4L5Идентификация зон60,272,70-Глюкоза0,431,332,03Ксилоза0,520,921,45РамнозаСодержание моносахаридов, %714,0701±1,2630;εср=8,98%0,2729±0,0564;εср=20,67%2,3149±0,1307;εср=5,65%13523Плоды облепихикрушиновиднойвысушенныеПлоды облепихикрушиновиднойсвежие3456Неидентифицированная зонаНеидентифицированная зона0,790,273,410,870,151,800,282,57-Глюкоза0,461,172,20Ксилоза0,520,921,27Рамноза0,790,273,410,860,161,690,282,57-Глюкоза0,431,331,93Ксилоза0,520,921,45РамнозаНеидентифицированная зонаНеидентифицированная зона735,5692±3,446;εср=9,69%Менее 0,05 %1,7049±0,0982;εср=5,76%45,3075±5,6708;εср=12,52%0,0742±0,00987;εср=13,30%0,6663±0,1441;εср=21,63%Рис.
51. Вид хроматограммы водного извлечения из высушенных плодов облепихи крушиновидной, подвергнутого кислотному гидролизу (3 мкл - объем пробы)Таким образом, установленны закономерности элюирования и математические модели,описывающие хроматографическое поведение растительных БАВ в тонком слое сорбента (таблица 78).С помощью предложенных зависимостей можно подбирать различные системы дляопределения БАВ, чтобы величина Rf укладывалась в оптимальные значения, а также прогнозировать возможность разделения сложных многокомпонентных смесей при заданной величинеполярности элюента.136Таблица 78Параметры установленных линейных зависимостей величины Rf БАВ от Р системы (где y= Rf, ах=Р)№БАВДиапазон лиR2УравнениеДиапазон Р сип/пнейностилинейнойстемы для полузависимостичения оптимальных величин RfЛипофильная фракция БАВ ЛРС и МЭ1β-каротин0-2,00,9756у=2,5383x+0,17290,05 - 0,1682Эргокальциферол0,58 - 1,100,9701у=1,0455x-0,510,77 - 1,063Ретинола ацетат0,73 - 1,100,9907у=0,388x-0,08470,20 - 1,104α-токоферол0,40 - 1,100,9830у=0,9647x-0,29760,62 - 0,93Гидрофильные БАВ ЛРС5Рутин4,90 – 6,300,974у=0,4762x-2,10955,06 – 5,696АсК4,0 - 4,700,9850у=0,7524x-3,01274,40 - 4,807Аргинин3,90 – 8,010,9545y=0,1293x–0,54086,50 – 8,828Глицин3,90 – 5,540,9243y=0,3074x–1,20724,90 – 5,889Глутаминовая кис5,13 – 6,000,9615y=0,6191x–2,79415,00 – 5,48лота10Валин3,90 – 5,270,9646y=0,4669x–1,82934,56 – 5,2011Лейцин3,90 – 5,270,9789y= 0,5433x–2,10074,42 – 4,9712Метионин3,90 – 5,270,9817y=0,477x– 1,8584,52 – 5,1513Пролин3,90 – 5,540,9056y=0,2982x–1,19635,02 – 6,0214Фенилаланин3,90 – 5,270,9851y=0,5243x–2,00394,39 – 4,9715Глюкоза5,13 – 6,330,9616y= 0,2321x–0,77894,65 – 5,9416Ксилоза4,42 – 5,220,9727y=0,075x+ 0,14092,12 – 6,1217Рамноза3,54 – 4,640,9937y=0,4367x–1,37363,83 – 4,5218Галловая кислота3,54 – 5,360,9777y =0,0827x+0,5407До 0,7219Кверцетин4,89 – 5,360,9529y=0,8792x–4,04924,95 – 5,29Таким образом, проведенные исследования показали, что определение и разделение втонком слое сорбента гидрофильных и липофильных БАВ ЛРС при совместном присутствии илипофильных БАВ МЭ требует различных подходов и приемов.
Алгоритм выбора подвижнойфазы и приемов проведения хроматографического анализа БАВ ЛРС и МЭ приведен на схеме 1.ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 31. Обоснована возможность теоретического подхода к выбору условий хроматографическогоопределения различных групп БАВ природного происхождения в тонком слое сорбент. Проведенные исследования, в зависимости от целей и объекта анализа, позволяют подбирать условия,в которых возможно определять отдельные БАВ в сложных многокомпонентных смесях безпредварительного разделения на отдельные компоненты;2.
Предложен алгоритм выбора подвижной фазы и приемов проведения хроматографическогоанализа, позволяющий достичь приемлемых критериев разделения БАВ ЛРС и МЭ (схема 1).137Схема 1. Алгоритм выбора подвижной фазы и приемов проведения хроматографического определения и разделения БАВ ЛРС и МЭ1383. Разработаны новые, простые в исполнении, экономически доступные, экспрессные методикиразделения, идентификации и количественного определения БАВ растительных объектов присовместном присутствии с применением различных вариаций метода ВЭТСХ;4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
