Диссертация (1139719), страница 24
Текст из файла (страница 24)
28 а. Градуировочный график для определения содержания АсК в области концентраций(0,15 – 0,45 %). Проявитель - 0,2% спиртовый раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия.Рис. 28 б. Градуировочный график для определения содержания АсК в области концентраций(0,05 –0,30%). Проявитель - 5 % спиртовый раствор ФМККалибровочная хроматограмма с серией стандартных растворов АсК и построенный наее основе график зависимости площади зоны от концентрации вещества в пробе (рис. 28 а) прииспользовании в качестве проявителя 0,2% спиртового раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолятанатрия, может использоваться в контроле качества ЛРС, многокомпонентных лекарственныхпрепаратов, биологически активных добавок, изделий пищевой, химической и косметологической промышленности. Данный реагент является специфичным для АсК и на хроматограммахне проявляет другие зоны сопутствующих веществ.
Это позволяет работать с водными извлечениями из ЛРС, которые содержат целый комплекс БАВ, и селективно определять содержаниеАсК в образце [203].109Предлагаемый способ был апробирован на ЛРС листьев крапивы двудомной и плодовоблепихи крушиновидной, которые, по данным литературы, богаты витамином С. Однако в НДопределение АсК не предусмотрено.Извлечение из исследуемого ЛРС готовили по общей фармакопейной статье ГФ ХIII изд.«Настои и отвары» [93].
Полученные вытяжки хроматографировали восходящим способом в условияхразработанной методики. Вид хроматограмм представлен на рис. 29 а и б. Сразу же после проявления хроматограмм, пластины сканируют, а полученные изображения обрабатывают компьютерной программой«Sorbfil Videodensitometer». Результаты количественного определения АсК в извлечениях из ЛРС по описаннойметодике были сравнены с результатами титриметрического определения по методике ГФ ХI [91] и представлены в таблице 54. Полученные данные свидетельствуют о сопоставимости результатов, а значит разработаннаяметодика является объективной и может рекомендоваться для включения в НД.Метрологическая оценка предложенной методики на примере плодов облепихи крушиновидной представлена в таблице 55.Проведена валидация разработанной методики по показателям предел обнаружения(ПО), специфичность, эффективность и повторяемость (внутри- и межлабораторная).1 2 31 2абРис.
29. Полученные хроматограммы: а. извлечения из листьев крапивы двудомной (1 – 3 мкл; 2 – 5мкл и 3 – 10 мкл извлечения). б. извлечения из свежих плодов облепихи крушиновидной (1 – 10мкл; 2 – 20 мкл извлечения). Проявитель 0,2% спиртовым раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолятанатрияТаблица 55Метрологическая оценка метода анализа (P = 95 %; n=4)xсрS2SSxcp∆x∆xcpεср, %ε, %0,0468 0,00000060,00077 0,00039 0,0025 0,001232,625,24Чувствительность методики устанавливали по величине обнаруживаемого минимумавещества в пятне, который визуально проявляется после детектирования. ПО с помощью выбранного реагента составил 2·10-6 г, что сопоставимо по чувствительности с определением витамина методом ВЭЖХ.110Специфичность определяли по величине Rf пятна контрольного трека, которое должносоответствовать Rf пятна стандартного образца (Rf = 0,42±0,01).
На треке контрольного образцавизуально обнаруживалось пятно, которое по интенсивности окраски и величине Rf соответствовало пятну АсК на треке стандартного образца (рис. 30 и 31).Эффективность пластинки определяли по числу теоретических тарелок пятен стандартных образцов и коэффициентам асимметрии пиков на хроматограммах. Данный показатель составил – 767, что соответствует допустимому критерию приемлемости (не менее 500). Коэффициенты асимметрии пиков представлены в таблица 56.
Считается, что искажения формы пикане сильно влияют на качество разделения при коэффициенте асимметрии, не превышающем 2 2,5.Рис. 30. Аналоговая кривая стандартного раствора АсКРис. 31. Аналоговая кривая извлечения из листьев крапивы двудомнойДля определения повторяемости методики идентификации АсК, хроматографированиебыло выполнено в шести повторностях для стандартных образцов АК на хроматографическихпластинках различных типов (таблица 57). Статистически обработанные результаты достоверны при доверительной вероятности 95%, а рассчитанные значения RSD не превышают рекомендованного критерия приемлемости ± 5%, а значит разработанная методика может быть признана прецизионной в условиях повторяемости (таблица 57).Следует отметить, что в отечественной литературе представлена подобная методика[279], имеющая ряд недостатков. Использование 0,01 М водного раствора нитрата серебра в качестве детектирующего реагента, который, во-первых, неспецифичен для АcК, во-вторых, об-111работанные им хроматограммы быстро темнеют, а слой силикагеля отделяется от подложки,что сказывается на результатах определения при несоблюдении строгих временных рамок отпроявления зон до сканирования.
Кроме этого, получаемые величины Rf АcК (0,75±0,01) выходят за рамки оптимальных рекомендуемых значений [39].Таблица 56Коэффициенты асимметрии пиков№ п/пХроматограмма1Калибровочная хроматограмма серии стандартных растворов АсКAs0,80-0,96Хроматограмма извлечения из листьев крапивы двудомнойХроматограмма извлечения из плодов облепихи крушиновидной0,83-0,941,15-1,1634Таблица 57Результаты определения повторяемости методикиПовторяемостьОбразецЗначение Rf стандартных образцов АсКПТСХ-А-АПТСХ-П-В10,4100,41023456ХсрRSD,%SD, %0,4200,4300,4300,4300,4300,4251,8960,810,4200,4200,4200,4400,4600,4281,8404,30Предлагаемый способ определения позволяет не только проводить идентификацию,устанавливать степень чистоты и количественное содержание, но и достигать на хроматограммах оптимальные величины Rf.Проведена валидация разработанной методики по показателямпредел обнаружения, специфичность, линейность, эффективность и повторяемость.
Методикаможет быть использована в контроле качества субстанции, монокомпонентных и комплексныхпрепаратов, ЛРС, БАД, премиксов, изделий пищевой и косметологической промышленностей.3.2.3. Исследование хроматографических характеристик аминокислот в тонком слоеВ качестве объектов исследования были выбраны такие протеиногенные АК, характеризующиеся различными кислотно-основными свойствами, как глицин, валин лейцин (алифатические нейтральные АК), метионин (АК, содержащая серу), пролин (иминокислота), аргинин(основная АК), глутаминовая кислота (кислая АК) и фенилаланин (ароматическая АК). Исследуемые 0,1% водные растворы АК объемом 1 мкл наносили на стартовую линию хроматогра-112фических пластин марок «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А, ПТСХ-АФ-В и ПТСХ-П-УФ высокоэффективные размером 10×10 см (тип сорбента: силикагель СТХ-1А, СТХ-1ВЭ; зернение: 5-17 мкм, 8-12мкм; толщина слоя: 90-120 мкм, 80-100 мкм соответственно; связующее: силиказоль).Выбор проявителя осуществляли с учетом анализа литературных источников, согласнокоторым, хроматографические пластинки обрабатывают 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне или 1 % спиртовым раствором нингидина, который образует с АК аммонийную сольенольной формы дикетогидринденкетогидринамина, имеющую стойкую сине-фиолетовуюокраску [251] при нагревании в сушильном шкафу при температуре 80 – 100 °С в течение 2-3минут.Результаты сравнительной характеристики исследуемых детектирующих реагентов приведены в таблице 58, данные которой свидетельствуют о том, что наилучшим реактивом попроявляющей способности для обработки пластин является 1% спиртовый раствор нингидрина.Кроме того, пластины не изменяют цвет при нагревании, зоны АК проявляются в виде розовых,оранжевых, сине-фиолетовых и малиновых пятен на белом фоне.Таблица 58№п/пАКПределы обнаружения АК [334]Предел обнаружения, г×10-80,2 % раствор нингидрина в аце1 % спиртовый раствор нинтонегидрина1Arg1012Gly2013Glu114Val255Leu236Met237Pro20108Phe23Arg – аргинин; Gly – глицин; Gly – глутаминовая кислота; Met – метионин; Pro – пролин; Phe –фенилаланин; Leu – лейцин; Val – валин.Для обоснования возможности использования теоретического подхода к выбору оптимальных условий хроматографического разделения АК необходимо было исследовать влияниеР элюентов на хроматографическую подвижность АК в тонком слое.
В эксперименте изученоболее двадцати типов подвижных фаз с различными значениями полярности [266,299,334] (таблица 59).Установили зависимость значения относительной подвижности АК от полярностиэлюента в диапазоне от 3,90 до 8,01 единиц (рис. 32). Данные рис. 32 показывают, что с увеличением полярности подвижной фазы исследуемые АК меньше удерживаются сорбентом, перемещаясь по пластине с элюентом, что сопровождается уменьшением значений коэффициентовраспределения (К) и ростом величин относительных скоростей перемещения (Rf).113Таблица 59Подвижные фазы, использованные для разделения АК в тонком слое [334](Arg – аргинин; Gly – глицин; Gly – глутаминовая кислота; Met – метионин; Pro – пролин; he –фенилаланин; Leu – лейцин; Val – валин)№ЭлюентRfPGluPheArgVal GlyMetLeuPro1Б0,0l20,0l20,0l0 0,0l1 0,0l0 0,0l2 0,0l2 0,0l0 3,902Б-У-В (8:l:l)0,2900,463 0,048 0,337 0,l69 0,37l 0,472 0,l45 4,643Б-У-В (7:l:l)0,2470,494 0,049 0,383 0,l85 0,395 0,469 0,l8l 4,724Б-У-В (6:l:l)0,2860,554 0,057 0,393 0,2l4 0,4l7 0,50 0,l9 4,835Б-У-В (5:l:l)0,4200,585 0,098 0,47l 0,494 0,494 0,576 0,244 4,966Б-У-В (4:l:l)0,3500,679 0,l07 0,5l8 0,337 0,554 0,639 0,293 5,l37Б-У-В (3:l:l)0,4400,701 0,145 0,524 0,370 0,561 0,675 0,357 5,388Б-У-В (4:l:5)0,300 0,565 0,l40 0,402 0,207 0,482 0,542 0,200 5,289Б-У-В (4:l:2)0,680 0,683 0,l73 0,494 0,294 0,54l 0,624 0,346 5,6910Б-У-В (l:4:l)0,7530,854 0,244 0,732 0,622 0,805 0,793 0,573 6,2811Б-У-В (l:2:l)0,7560,8l0 0,352 0,736 0,652 0,736 0,79l 0,553 6,3312Б-У-В (l:6:l)0,6980,750 0,l72 0,7l4 0,588 0,738 0,776 0,5l2 6,2613Б-У-В (l:l:6)0,84l0,905 0,346 0,845 0,829 0,843 0,83l 0,632 8,0l14Б-МК-В (4:l:l)0,530 0,723 0,325 0,707 0,482 0,707 0,805 0,434 5,2715Б-ЭЭ-У-В (9:6:3:l)0,2400,405 0,024 0,32l 0,l3l 0,3l0 0,38l 0,l0 4,2216Э-МК-В (4:l:l)0,630 0,70l0,l45 0,524 0,370 0,56l 0,675 0,357 5,5417Э-У-В (4:l:5)0,8500,908 0,243 0,769 0,838 0,9l6 0,876 0,60l 6,8418Ас-У-В (2:l:l)0,3750,6l0 0,l76 0,494 0,293 0,494 0,570 0,3l3 5,6019Х-МК-В (4:l:2)0,9600,798 0,2l4 0,989 0,9l2 0,934 0,90l 0,4l2 6,0920Х-У-В (4:2:2)0,9400,763 0,205 0,844 0,798 0,867 0,889 0,402 6,0021А-У-В (4:l:5)0,9500,898 0,342 0,90l 0,854 0,909 0,899 0,635 7,2822А-У-В (4:2:2)0,9300,876 0,238 0,859 0,753 0,93 0,882 0,6l2 6,5023Эт- конц.
раствор NH3 0,357 0,744 0,l46 0,720 0,50 0,744 0,744 0,45l(l6:4,5)Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; М - метанол; Х – хлороформ; Г – гексан; Б – бутанол; Т – толуол; Бн – бензол; Эт – этанол; А – ацетон; МК – муравьиная кислота;ЭЭ - этиловый эфир; Ас – амиловый спиртЭтот факт может объясняться тем, что сами АК, за счет присутствия карбоксильной,амино- и иминогрупп, являются полярными соединениями. Как видно из графика на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
