Диссертация (1139719), страница 20
Текст из файла (страница 20)
986а и б). Выявленные зависимости продемонстрировали, что для получения оптимальных величинRf [39] витамина D2 на хроматограммах cодержание данных растворителей в системе должнобыть от 75 до 77 и от 25 до 23 % для гексана и хлороформа соответственно. На основе полученных данных построена кривая зависимости величины Rf витамина D2 (рис. 10) от полярностиподвижной фазы (Р) в интервале от 0 до 4,4 ед. полярности.Таблица 37Данные величины Rf витамина D2 в различных системах для хроматографирования (n=3)№Состав подвижной фазыРRfКп/п0,361Г-Эт (15:0,1)0,030,78±0,012Г3456789101112Г – Х (10:1)Г – Х (5:1)Г – Х (4:1)Г – Х (3:1)Г – Х (2:1)Г – Х (1:1)Г-ЭЭ (4:1)O-ЭЭ (4:1)Т-ЭЭ (4:1)Х00,400,730,881,101,472,200,580,741,944,400,03±0,00239,000,04±0,0020,27±0,020,35±0,010,67±0,030,85±0,010,93±0,010,11±0,010,09±0,0020,23±0,010,99±0,0124,002,701,860,670,180,088,1010,113,350,01110,80,8Величина R fВеличина R fГ – Х – гексан-хлороформ; Г – гексан; Эт – этанол; ЭЭ – диэтиловый эфир; О – октан;Х – хлороформ; Т - тетрахлорметан0,60,40,60,40,20,200020406080100Содержание хлороформа в п.
ф., % (по объему)020406080100Содержание гексана в п. ф., % (по объему)абРис. 9. Зависимость величины Rf эргокальциферола от содержания хлороформа (а) и гексана (б)в элюенте (неподвижная фаза – силикагель)Когда величина Р системы достигает 2,5 ед. и более (рис. 10), значение Rf эргокальциферола становится не зависимым от полярности элюента (Rf → 1). При детальном анализе влияния Р системы в диапазоне от 0,5 до 1,2 ед.
на величину Rf, выбран интервал значений Р элюента, обеспечивающий линейность данной зависимости (от 0,58 до 1,1 ед.) (рис. 11).871,2Величина Rf10,80,60,40,20012345Полярность системы (Р)Рис. 10. Влияние полярности элюирующей системы на величину Rf0,8y = 1,0455x - 0,510,72R = 0,9701Величина Rf0,60,50,40,30,20,100,50,70,91,11,3Полярность системы (Р)Рис.
11. Линейная корреляция величины Rf и значения полярности системыС помощью выявленной зависимости возможно составлять различные системы дляопределения витамина D2 в тонком слое сорбента, чтобы величина Rf находилась в пределахоптимальных значений [39]. Экспериментально установлено, что интервал полярности элюентаможет изменяться от 0,77 до 1,06 ед. [226].Таким образом, совокупность полученных результатов позволила выбрать и теоретическиобосновать оптимальные условия определения эргокальциферола методом ТСХ: сорбент – пластинки силикагелевые марки «Sorbfil» (ПТСХ-А) 10×10 см с полимерной подложкой; оптимальныйобъем пробы – 0,5 мкл 0,035 мг/мл спиртового раствора витамина D2; возможные элюенты –гексан-хлороформ (4:1) или (5:1); тетрахлорметан-диэтиловый-эфир (4:1); проявитель – 5 %спиртовый раствор ФМК; время насыщения камеры парами элюента – 20 мин; время развитияхроматограмы – 25 мин; время термостатирования при t º ≥ 80 ºС - 5 – 7 мин; предел обнаружения эргокальциферола - 7·10-9 г.883.1.3.
Изучение закономерностей хроматографического поведениявитамина АДля обнаружения пятен ретинола ацетата (ФС 42-7811-97) [352], выбранного в качествестандартного образца при разработке методики, были использованы реагенты, предложенные влитературе [90,91,132,374]. Обработка пластин конц. серной кислотой дает темно-фиолетовые зонына белом фоне, разв. серной кислотой – синие пятна на белом фоне, 5% спиртовым растворомФМК и 10 % спиртовым раствором ФМК с добавлением конц. хлористоводородной кислоты(25:1) – темно-синие пятна на желто-зеленом фоне и 70 % хлорной кислотой - фиолетовые пятна на белом фоне.
В литературе часто рекомендуется для этой цели использовать труднодоступеный и весьма токсиченый хлороформный раствор хлорида сурьмы (III или V). Детектирование пятен проводят также путем просмотра пластин в УФ-свете. Наблюдаются темные зоны витамина А на светлом флуоресцирующем фоне [289]. Детектирующим реагентом, отвечающимвсем требованиям, является 10 % спиртовый раствор ФМК с добавлением концентрированнойхлористоводородной кислоты. Нами также было установлено, что предел обнаружения с помощьювыбранного детектирующего агента составил 1·10-7 г (0,1 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл).
Вэлюентах, представленных в таблице 38, хроматографировали пробы раствора ретинола ацетатаобъемом 0,5 мкл с содержанием 1 мг/мл.В литературе в качестве элюентов чаще всего предлагаются такие однокомпонентныесистемы как: бензол, хлороформ, гексан, циклогексан, толуол, ксилол, метанол и другие[132,374].
В эксперименте изучено десять различных хроматограческих систем со значениямиполярности от 0 до 2,20 ед. (таблица 38).Таблица 38Характеристики элюирующих систем для определения витамина А№Состав элюирующей сиСоотношениеРКRfп/пстемырастворителей1Г099,000,01±0,0022Г–Х1:12,200,090,92±0,013Г–Х2:11,470,180,85±0,024Г-Э2:11,430,020,98±0,015Г - Эт15:0,10,030,140,88±0,016Г–Х10:10,4013,290,07±0,017Г–Х5:10,734,260,19±0,018Г–Х4:10,883,170,24±0,019Г–Х3:11,101,780,36±0,0110Г-Б14:10,2099,000,01±0,002Г– гексан; Х – хлороформ; Э – этилацетат; Б – бензол; Эт - этанолНаилучшее качество хроматографических зон и оптимальные величины Rf [39] получены в системах № 8 и 9.89Изменение в бикомпонентных подвижных фазах № 1-3, 6-9 (таблица 38) процентногосодержания хлороформа и гексана позволило получить кривые зависимости величины Rf отобъемной доли каждого растворителя в элюенте (рис.
12 а и б).Полученные графики показали, что зоны витамина А на хроматограммах могут достигать оптимальных значений Rf [39] при содержании хлороформа и гексана в системе от 20 до 30и от 70 до 80% соответственно. По экспериментальным данным построена кривая зависимости110,80,8Величина R fВеличина R fвеличины Rf витамина А (рис.
13) от Р системы.0,60,40,20,60,40,200020406080010020406080100Содержание гексана в п. ф., % (по объему)Содержание хлороформа в п. ф., % (по объему)абРис. 12. Взаимосвязь относительной скорости перемещения ретинола ацетата от содержанияхлороформа (а) и гексана (б) в системе (сорбент – силикагель)Увеличение полярности системы от 0 до 1,5 ед. и более (рис.
13) приводит к тому, чтозначение величины Rf зон ретинола ацетата на хроматограммах теряет зависимость от Р элюента. Определяемый компонент при этом не сорбируется силикагелем (Rf → 1).1Величина Rf0,80,60,40,20012345Полярность системы (Р)Рис. 13. Кривая влияния полярности элюирующей системы на величину Rf в диапазоне от 0 до4,4Детальное исследование влияния Р системы в диапазоне от 0,1 до 1,5 ед.
на значения Rf,позволило установить тот интервал значений Р элюента, при котором выявленная зависимостьпреобретает линейный характер (от 0,2 до 1,1 ед. полярности) (рис. 14).С помощью установленной зависимости возможно комбинировать различные растворители при составлении системы для определения витамина А в тонком слое, таким образом, что-90бы величина Rf показывала оптимальные значения [39]. На основании уравнения прямой рассчитан интервал полярностей элюента, который должен составлять от 0,73 до 1,1 ед. [289].0,4y = 0,388x - 0,0847Величина Rf0,35R2 = 0,99070,30,250,20,150,10,05000,20,40,60,811,2Полярность системы (Р)Рис. 14. Вид линейной зависимости величины Rf ретинола ацетата от полярности элюентаСовокупности полученных экспериментальных данных позволила подобрать оптимальныеусловия хроматографического определения витамина А: сорбент – пластинки силикагелевые марки«Sorbfil» (ПТСХ-А) с полимерной подложкой размером 10 х10 см; возможные элюенты – гексан:хлороформ (5:1), (4:1), (3:1); объем пробы – 0,5 мкл 1 г/мл раствора; детектирование зон –10% спиртовый раствор ФМК с добавлением конц.
хлористоводородной кислоты; время насыщения хроматографической камеры парами элюента – 20 мин; время развития хроматограммы –25 мин; время термостатирования при tº = 50 – 60º С - 5 – 7 мин.3.1.4. Изучение закономерностей хроматографического поведения и количественноеопределение витамина Е в тонком слоеНа хроматографическую пластинку марки «Sorbfil» размером 10×10 см наносили пробуспиртового раствора объемом 10 мкл с содержанием α-токоферола (чистота 97 %, «ICN Biomedical», США) 3 мг/мл.
Для детекции зон токоферолов на хроматограммах были использованыреагенты, приведенные в таблице 39 [174,238,364,365].Как известно, ФМК является неспецифичным проявителем. Раствор гексацианоферрата калия(III), по нашим данным, не обладает требуемой чувствительностью. Использование серебра нитратадля обработки пластин экономически нецелесообразно, ввиду его высокой рыночной стоимости.Впервые выбрана в качестве проявителя конц. азотная кислота, образующая с α-токоферолом отокоферилхинон, окрашенный в оранжево-красный цвет. Данная реакция рекомендована ГФ [90-92]для установления подлинности ацетета токоферола.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
