Диссертация (1139719), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Тогда как витамины А, Е и D2 при таких значениях полярности прочно удерживаются сорбентом, оставаясь на линии старта. Для них оптимальные величины Rf достигаются в системах № 6-8 (таблица 42), когда полярность подвижной фазы находится в интервале0,73 – 1,10. Это означает, что за одну процедуру хроматографирования разделить данные витамины с высокой эффективностью разделения не представляется возможным.Однако, данную задачу возможно решить при использовании фронтального элюирования. Более детальное изучении влияния полярности системы на величину Rf для каждого ЖРВпозволило выбрать интервал значений Р элюента, в котором данные зависимости приобретаютлинейный характер (от 0 до 0,2 ед.
полярности системы для β-каротина; от 0,4 до 1,1 ед. для витамина Е; от 0,58 до 1,47 ед. для эргокальциферола и от 0,7 до 1,5 для витамина А) (рис. 19).Рис. 18. Вид влияния полярности элюента на величины Rf ЖРВРис. 19. Вид линейных зависимостей величин Rf ЖРВ от значения полярности элюентаС помощью предложенных зависимостей можно подбирать различные системы для разделения изучаемых ЖРВ в тонком слое сорбента при совместном присутствии, таким образом,чтобы величина Rf укладывалась в оптимальные значения. Следовательно, исходя из уравненийпрямых (рис.
19), интервал полярностей элюента может варьировать в достаточно узком диапазоне от 0,05 до 0,168 ед. (для β-каротина); от 0,62 до 0,93 ед. (для витамина Е); от 0,76 до 1,0797ед. (для эргокальциферола) и от 0,95 до 1,26 (для витамина А). Разработана методика [201] разделения ЖРВ методом фронтальной ТСХ, позволяющая не только разделять смесь, но и достигать на хроматограммах оптимальных величин Rf .Таким образом, оптимальные условия хроматографирования: силикагелевые пластинки марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А размером 5×10 см; элюент 1 –гексан:хлороформ (19:1) – высота пробега 8 см; элюент 2 – гексан хлороформ (3:1) – высотапробега 6 см; проявитель – 5 % спиртовый раствор ФМК; оптимальный объем пробы –10 мклспиртового раствора β-каротина с содержанием 1 мг/мл, по 0,5 мкл спиртовых растворов витаминов А, Е и D2 с содержанием 1 мг/мл, 10 мг/мл и 0,035 мг/мл соответственно; время насыщениякамеры парами элюентов 1 и 2 – 20 мин; общее время элюирования – 55 мин; время выдерживания пластинки в термостате после проявления при t º ≥ 80 ºС – 3-5 минут.Проведена валидация разработанной методики по показателям предел обнаружения(ПО), специфичность, эффективность и повторяемость.Чувствительность методики устанавливали по величине обнаруживаемого минимумавещества в пятне, который визуально проявляется после детектирования.
ПО с помощью выбранных реагентов представлен в таблице 44. Выбранные способы детекции зон на хроматограммах отличаются достаточной чувствительностью, что сопоставимо по чувствительности сопределением данных ЖРВ методом ВЭЖХ, а также экономически доступны.Таблица 44Предел определения исследуемых ЖРВ№п/пЖРВПО, г1Витамин А1·10-82Витамин Е1·10-63Витамин D27·10-94β-каротин1·10-5Специфичность определяли по величине Rf пятна контрольного трека, которое должносоответствовать Rf пятен стандартных образцов. Для определения специфичности также проводился эксперимент с плацебо (рафинированное соевое масло, часто используемое в качестверастворителя при производстве масляных препаратов ЖРВ). Спиртовые растворы данного видамасла хроматографировали в системе гексан-хлороформ (3:1) параллельно со стандартными образцами ЖРВ. Обнаружено пять хроматографических зон с величинами Rf, равными0,01±0,001; 0,04±0,01; 0,1±0,02; 0,15±0,02 и 0,64±0,03.
Результаты представлены в таблице 45.Данные таблицы 45 свидетельствуют о соответствии разработанной методики критериюприемлемости. На хроматограмме плацебо отсутствуют пятна на уровне зон стандартных образцов.98Эффективность пластинки определяли по числу теоретических тарелок зон стандартныхобразцов (таблице 46). Данный показатель соответствует допустимому критерию приемлемости(не менее 500).Таблица 45Результаты определения специфичности методикиЗначение RfЗначение Rf стандартных образцов ЖРВАЕ0,36±0,001 0,76±0,001D20,69±0,020β-каротин0,98±0,010(масло - плацебо)0,01±0,0010,04±0,0100,1±0,0100,15±0,0200,64±0,030Таблица 46Результаты расчета эффективности пластин в методике№ п/пЖРВН, мкмN1Витамин А5012002Витамин Е93645,163Витамин D2551090,914β-каротин138601,45Разработанная методика была апробирована на РМ плодов облепихи.
Выделение ЖРВ изпрепаратов осуществляли методом реперколяции. В качестве экстрагента использовали спиртэтиловый 95%, несмешивающийся с масляной фазой и обладающий хорошей растворяющейспособностью для ЖРВ.Полученную суммарную вытяжку из РМ в количестве 5 мкл наносили на стартовую линию хроматографической пластинки и хроматографировали в системе 1 (пробег 8 см), а затем в системе 2 (пробег 6 см).Вид хроматограммы представлен на рис.
20. Параметры хроматографического разделения приведеныв таблице 47.Таблица 47№п/п123Эффективность разделения ЖРВ в облепиховом масле методом ТСХПараметр эффективности разделе- Эргокальци- Токоферолаβ-каротиннияферолацетатВеличина Rf±0,020,6l0,760,78Коэффициент распределения (К)2,570,390,28Селективность сорбции (L)5,59l,40Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительном разделении хроматографических зон ЖРВ на хроматограммах (так как критерием эффективного разделения является величина L>1) и правомерности использования данной методики.Для определения повторяемости, полный метод разделения и идентификации ЖРВ, былвыполнен трижды для образцов готовых продуктов. Результаты представлены в таблице 48.99Рис.
20. Вид хроматограммы 5 мкл спиртовой вытяжки из масла плодов облепихи при фронтальном хроматографированииВ испытании были получены пятна с примерно одинаковыми интенсивностями и значениями Rf. Рассчитанные значения RSD не выходят за пределы верхнего допустимого интервалакритерия приемлемости ± 5%, что свидетельствует о соответствии данной методики по показателю «прецизионность в условиях повторяемости».Проведено сравнение основных характеристик разработанной ТСХ-методики для определения ЖРВ при совместном присутствии с методиками, основанными на применении ВЭЖХ,для установления целесообразности ее использования в фармацевтическом анализе [314] (таблица 49).Образец123RSD,%εср, %Таблица 48Результаты определения повторяемости методикиПовторяемостьЗначение RfЗначение Rf ЖРВстандартных образцов ЖРВАЕD2β-каротинМасло облепихи0,360,760,640,780,610,760,350,770,670,790,780,370,750,680,774,293,034,860,9065,333,447,731,12Таблица 49Сравнение основных характеристик методик определения ЖРВ [314]№ п/пВЭЖХПредложенная ТСХ-методика123Оценка подлинности1++Испытание на чистоту и допустимые пределы примесей2++Количественное определение3+-100124+3Анализ смесей ЖРВ567891011+Предел обнаружения7 нг (эргокальциферол); 1 мкг (токоферола ацетат);10 нг (ретинола ацетат); 10 мкг (β-каротин)Возможные объекты анализаКонтроль качества РМ, МЭ, субстанций ЖРВ, монокомпонентных ЛП на основе ЖРВ, комплексных поливитаминных ЛП (фармацевтичекая и пищеваяиндустрии), косметологические изделияЦена комплекта оборудованияЗначительная (до 1,8 млн.Не значительная (до 20 тыс.
руб.)руб.)Дополнительная комплектация оборудованияДля каждого анализируемого Универсальность метода ТСХ (может быть исобъекта требуется смена копользован для анализа различных групп БАВ)лонкиВремя выполнения 5 определений20-30 мин.30-40 мин.Количество анализов в час≈ 20≈ 10Смена элюента и растворителяТребует расхода большогоНебольшой расход растворителя (20-50 мл),количества растворителя,легкость смены элюента продолжительностьютрудоемка и длительна– 5 мин≈1 мкгРазработанная методика, таким образом, может быть рекомендована для практическогоприменения только для идентификации и разделения смесей ЖРВ. Она обладает характеристиками, сопоставимыми с основным методом определения ЖРВ в настоящее время - методомВЭЖХ.
Следует отметить, что в зависимости от поставленных целей анализа, применение ТСХметодики может являться более предпочтительным в виду экспрессности и низкой стоимостианализа [201, 314,315,335].3.2. Исследование хроматографических характеристик гидрофильных БАВ в тонком слоесорбента3.2.1. Количественное определение рутина методом ТСХДля визуального определения качества разделения хроматографическую пластину после элюирования необходимо обработать каким-либо детектирующим реагентом.
В качестве реагентов (таблица 50) для идентификации зон рутина были использованы рекомендованные в литературе: 5%спиртовый раствор ALCL3; 5% спиртовый раствор ФМК; пары аммиака; 5% водный или спиртовый раствор NaOH. Впервые, в качестве проявителя, был предложен 10% спиртовый раствор101NaOH, образующй с рутином соединение, окрашенное в желто-оранжевый цвет – халкон[137,200,275,281, 367].Немаловажным фактом, наряду с высокой чувствительностью, специфичностью и доступностью, является то, что обработанные этим реагентом хроматограммы не изменяют интенсивности окраски с течением времени (более 30 дней), а значит, ошибка количественной оценкиданных ТСХ будет минимальной. Предел обнаружения зон с помощью выбранного детектирующего реагента составил 5 ·10-7 г.
Предел количественного определения составил 1 мкл раствора с содержанием рутина 0,0005 г/мл.Таблица 50Характеристика основных используемых для обнаружения рутина методом ТСХ детектирующих реагентовОкрашивание зон на хроматограммах№Проявительп/пвидимый светУФ-свет1Бледно-желтоеЖелтовото-бурое5% спиртовый раствор алюми2Бледно-желтоения хлоридаКрасновато-бурое3Пары аммиака5% водный раствор натрия гид4Оранжево-буроероксида10% спиртовый раствор натрия5Оранжево-буроеЖелтовато-буроегидроксида65% спиртовый раствор ФМКЗеленовато-синееПри исследовании БАВ сложного строения, таких как флавоноиды, необходим экспериментальный подбор оптимальных условий разделения.Состав элюента играет определяющую роль при проведении ТСХ-анализа. Изучены подвижные фазы с различными значениями полярности (таблица 51), предложенные в литературе[14,31,96,133,142,143,215].Таблица 51Параметры эффективности определения рутина в различных элюентах№п/п11234567891011Подвижная фазаRfРН, ммN2Бн-Эт-У(45:8:3)30,l30±0,0l43,4952,50629,60БУВ (4:l:5)Э-Г-Х-Б (40:30:20:l0)Э-Эт-В (l00:27:l3)Э-В-У (l0:l0:40)X-А (50:40)Э-У-В (7,5:l,5:l,5)Х-М-В (26:l4:3)У-В (l5:85)У-В (60:40)X-Г (l:l)0,700±0,0l0,00l±0,0l0,l95±0,0l0,9l0±0,0l0,700±0,020,455±0,0l0,450±0,020,990±0,0l0,900±0,0l0,00l±0,0l6,682,994,9l6,354,845,245,448,587,322,200,4625,00l3,l00,06l9,l00,7ll32,000,050,l264,00l53,202,925,57l303,604,03100,800,50l57l,4363l,l5l,001021122Э-Эт-Т (4:2:2)30,1l0±0,0l44,0854,006l9,00Э – этилацетат; У – ледяная уксусная кислота; В – вода; М - метанол; Х – хлороформ; Г – гексан; Б– бутанол; Т – толуол; Бн – бензол; Эт – этанол; А - ацетонРассчитав величину полярности исследованных элюентов (Р), получали зависимостьзначения величины относительной подвижности рутина от полярности системы (рис.
21). Видкривой демонстрирует существование интервалов полярности элюента от 3,5 до 4,5 и от 3,3 до4,0, в которых величина Rf практически не изменяется. В диапазоне от 0 до 3,0 при использовании силикагелевых пластин (нормально-фазовый вариант ТСХ) рутин прочно связывается сорбентом, не перемещаясь с линии старта. При увеличении полярности системы 7,5 и более рутинперемещается с током подвижной фазы, практически не удерживаясь сорбентом (Rf →1).
Такимобразом, наиболее оптимальные величины Rf (0,3-0,6) [39] можно получить при использованииподвижных фаз с узким интервалом полярности от 5,0 до 6,0 единиц (рис. 21).Для каждой элюирующей системы на хроматограммах были рассчитаны такие хроматографические параметры, как величины R ; H; N [39]. Данные таблицы 51 демонстрируют, чтонаибольшая эффективность хроматографирования, согласно значениям величин N и Н, наблюдалась в системах № 2, 5, 7, 9 и 10, а наименьшая - в системах № 8 и 11. Оптимальные величины Rf отмечены для систем № 7 и 8.Несмотря на то, что системы № 5, 9 и 10 показывали большее значение величины N, чемсистемы № 2 и 7, качество зон на хроматограммах было значительно хуже, что затрудняло ихдальнейшую обработку. Лучшее значение Rf и качество хроматографических зон было достигнутов системе № 7 (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
