Диссертация (1139719), страница 35
Текст из файла (страница 35)
62. Доля незаменимых АК в составе комплекса АК изучаемого ЛРСТаким образом, содержание незаменимых АК в составе комплекса АК листьев крапивыдвудомной в 2,6 раза превышает таковое в комплексе АК плодов облепихи крушиновидной высушенных (рис. 62).Полученные результаты количественного определения глутаминовой кислоты методомВЭТСХ (Глава 3, п. 3.2.3.1) свидетельствуют о том, что данная АК вносит различный вклад вобщую сумму свободных АК в ЛРС (рис. 64). Большая часть глутаминовой кислоты находитсяв ЛРС в связанном состоянии.170абРис.
63. Состав комплекса незаменимых АК изучаемого ЛРС0,33Доля глутаминовой кислоты в сумме0,011свободных АК листьев КД, %5,095,5073Доля глутаминовой кислоты в суммесвободных АК плодов ОК высушенных,%Рис. 64. Вклад глутаминовой кислоты в общую сумму свободных аминокислот ЛРСТаким образом, проведено исследование аминокислотного состава (свободные и связанные АК) плодов облепихи крушиновидной и листьев крапивы двудомной с применением современных физико-химических методов (ТСХ и КЭ).1714.4.3. Определение жирорастворимых витаминов в растительных объектах методом ТСХЛРС не стандартизируется, согласно НД, по содержанию (жирорастворимых витаминов)ЖРВ, составляющих значитеьную часть липофильной фракции [15,91,93].
Однако, роль ЖРВ вуникальной комбинации, присутствующей в ЛРС, для организма человека трудно переоценить.Избирательностью в отношении триглицеридов, каротиноидов, фитостеринов и токоферолов обладают этанол и гексан, что определило выбор данных растворителей в качестве экстрагентов. Методика получения извлечений из листьев крапивы двудомной и плодов облепихикрушиновидной для определения ЖРВ описана в Главе 2 (п. 2.2.10).Для идентификации и разделения ЖРВ была использована хроматографическая система,подобранная и описанная в Главе 3 (п. 3.1.5).
Детектирующим реагентом, отвечающим всемтребованиям, является 5% спиртовый раствор ФМК (Глава 3, п. 3.1.5). Зоны визуализировалисьна хроматограммах в виде синих пятен на желто-зеленом фоне.Для выбранной ранее хроматографической системы (гексан-хлороформ 3:1) рассчитывали основные хроматографические параметры ЖРВ в тонком слое (таблица 106).Таблица 106№ п/п123Хроматографические параметры ЖРВ [306]ЖРВRfКэргокальциферол0,65±0,030,54Токоферола ацетат0,78±0,020,28β-каротин0,99±0,010,01L1,9328Результаты свидетельствуют о правомерности использования данной системы для разделения ЖРВ методом ТСХ [39]. Вид полученных хроматограмм представлен на рис.
65. Полученные извлечения из исследуемого ЛРС в количествах 40 и 100 мкл хроматографировали напластинах марок «Sorbfil» ПТСХ-АФ-А, ПТСХ-П-В и ПТСХ-П-А-УФ. Оптимальный объемпробы составил 100 мкл. Вид полученных хроматограмм представлен на рис. 66 и 67. Идентификация зон на хроматограммах представлена в таблице 107.На полученных хроматограммах обнаружено по восемь зон при использовании гексана иэтанола в качестве экстрагентов. Данные рис. 66 и 67, показывают, что на хрoматoграммах семьзон являются общими с величинами Rf = 0,01±0,02; 0,04±0,02; 0,10±0,02; 0,16±0,02; 0,65±0,02;0,79±0,01; 0,99±0,01.Вид хроматограммы извлечения из листьев крапивы двудомной свидетельствовал оналичии специфической зоны со значением Rf = 0,58±0,02. При анализе хроматограммы извлечения из плодов облепихи установлена характерная зона с величиной Rf = 0,19±0,01.172Рис.
65. Вид хроматограммы стандартных образцов жирорастворимых витаминов: 1 – витаминD2; 2 – витамин Е; 3 – β-каротинРис. 66. Вид хроматограммы извлечений из листьев крапивы двудомной после проявления 5% спиртовым раствором ФМК: 1 – объем пробы 40 мкл; 2 – объем пробы 100 мкл гексанового извлечения; 3 – объем пробы 100 мкл извлечения (гексан-этанол 1:1)Рис.
67. Вид хроматограммы извлечения из плодов облепихи крушиновидной после проявления5% спиртовым раствором ФМК: 1 – объем пробы 40 мкл; 2 – объем пробы 100 мкл173В связи с этим мы предполагаем, что хроматографический профиль извлечений из ЛРСможно использовать для его стандартизации. Так как в извлечениях, полученных с применением смеси экстрагентов гексан-этанол (1:1), зоны витаминов D2 и Е не идентифицированы (рис.66, точка 3), обсуждение полученных хроматографических профилей БАВ не приводим. Идентификация зон витаминов D2, Е и β-каротина на полученных хроматограммах в сравнении с достоверными стандартными образцами приведена в таблице 107.Таблица 107Идентификация зон ЖРВ на хроматограммах [306]Цвет зон в№ИдентификацияRf±0,02КLзонывеществавидимом светеУФ-светеИзвлечение из листьев крапивы двудомной, полученное с применениемгексана (ПТСХ-П-В)10,0199,00 4,1320,0424,00 2,6730,109,001,5940,155,677,8850,580,721,4760,670,491,96Витамин D270,800,25 25,00Витамин Е80,990,01оранжеваяβ-каротинИзвлечение из листьев крапивы двудомной, полученное с применениемсмеси гексан-этанол (1:1); ПТСХ-П-А-УФ10,0199,00 6,3220,0615,67 1,94 светло-зеленаярозоваяхлорофилл b30,118,091,32темно-зеленаярозоваяхлорофилл анеидентифицирован40,146,141,17зеленаярозоваяный хлорофилл50,165,251,5760,233,3533570,990,01Оранжеваяβ-каротинИзвлечение из плодов облепихи крушиновидной, полученное с применением этанола(ПТСХ-АФ-А)10,0199,00 6,3220,0615,67 1,9430,118,091,6640,174,881,1550,194,267,2260,630,592,11Витамин D270,780,2828Витамин Е80,990,01оранжеваяβ-каротинТаким образом, с помощью разработанной методики в изучаемом ЛРС обнаруженыЖРВ.
Вид хроматографического профиля ЖРВ извлечений из ЛРС целесообразно использоватьдля оценки его подлинности и доброкачественности.1744.4.4. Разработка методики определения танина и галловой кислоты при совместномприсутствии в фармацевтических субстанцияхрастительного происхожденияСпектрофотометрические методы, несмотря на невысокую селективность, по-прежнемунаходят широкое применение в анализе ЛС благодаря сравнительной доступности, дешевизне,простоте в сочетании с хорошей точностью. Более перспективным подходом к оценке количественного содержания ДВ в ЛРС и ФП считается использование различных спектрофотометрических методик.
Известен метод спектрофотометрического количественного определения суммы ДВ в пересчете на кислоту галловую в боратном буферном растворе с рН=9,0 [234] (рис.68).оптическая плотность10,80,620,410,20200220240260280300320340длина волны, нмРис. 68. Спектр поглощения водного извлечения из листьев крапивы двудомной: 1 – вода; 2 –боратный буферный раствор с рН=9,0Однако, в данной методике измерения рекомендуется проводить при длине волны 277±2нм (галловая кислота, рис.
69), в то время как более выраженный максимум поглощения для извлечений из некоторых видов ЛРС, в боратном буферном растворе оказывается батохромносдвинут (294±2 нм на примере извлечения из листьев крапивы двудомной).Для выявления компонента суммы ДВ, определяющего положение максимума в извлечении при 294±2 нм, измерили спектр поглощения танина (рис.
70). Однако, раствор танина вборатном буферном растворе находился при 305±2 нм. Т.е. в извлечении из листьев крапивымаксимум находился между максимумами галловой кислоты и танина, что позволило сделатьпредположение о том, что в извлечении присутствует сумма данных БАВ в определенном соотношении, максимумы которых накладываются.175Танин в водном раствореоптическая плотность, А1Галловая кислота в водном растворе0,8Танин в боратном буферном растворе0,6Галловая кислота в боратном буферномрастворе0,40,20200220240260280300320340длина волны, нмРис.
69. Спектр поглощения растворов стандартных образцов галловой кислоты и танина в водеи боратном буферном растворе с рН=9,0В случае перекрывающихся спектров поглощения индивидуальных соединений используют метод Фирордта, включенный в ГФ РФ [26,92]. Спектры поглощения смеси растворовстандартных образцов галовой кислоты и танина в боратном буферном растворе с рН=9,0 приведены на рис. 69. Данные рис. 70 свидетельствуют о присутствии в извлечении галловой кислоты и танина в примерном соотношении 1:2.1Оптическая плотность1,7521,531,254150,750,50,250270280290300310320Длина волны, нмРис.
70. Спектр поглощения смеси растворов стандартных образцов галовой кислоты и танина вборатном буферном растворе с рН=9,0: 1 – (1:1); 2 – (1:2);3 – (1:4); 4 – (1:6); 5 – извлечение из листьев крапивы двудомной176Поэтому возникла необходимость в разработке методики спектрофотометрического количественного определения данных БАВ при совместном присутствии с применением расчетного метода Фиррордта. Для чего были рассчитаны величины удельных показателей поглощения галловой кислоты и танина в боратном буфере при длинах волн 275 и 305 нм (максимумыпоглощения индивидуальных БАВ).
Данные представлены в таблице 108.Таблица 108Величины удельных показателей поглощения галловой кислоты и танина в боратном буферепри длинах волн 275 и 305 нм№ п/пДВВеличины удельных показателей поглощения275 нм305 нм1Кислота галловая426,44141,8042Танин348,99619,43Установлены диапазоны линейной зависимости оптической плотности исследуемыхБАВ от концентрации в растворе (рис. 71 и 72).1,4Оптическая плотность1,21А (275 нм) = 0,1818С - 0,1744R² = 0,99570,80,6А (305 нм) = 0,057x - 0,0609R² = 0,99580,40,200,0002 0,0004 0,0008 0,0012 0,0016 0,002 0,0024 0,0028Концентрация стандартного образца галовой кислоты, %Рис.
71. Графики линейной зависимости оптической плотности при двух длинах волн от концентрации галловой кислоты в растворе, %Оптическая плотность1,61,41,21А (305 нм) = 0,2355С - 0,1821R² = 0,99270,80,60,4А (275 нм) = 0,135С - 0,1089R² = 0,99160,200,0002 0,0004 0,0008 0,0012 0,0016 0,002 0,0024Концентрация стандартного образца танина, %Рис. 72. Графики линейной зависимости оптической плотности при двух длинах волн от концентрации танина в растворе, %177Количественное определение методом спектрофотометрии. Т.н.
(около 2,0 г) измельченногосырья помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл, заливают нагретой до кипения водой в количестве 250 мл и кипятят с обратным холодильником при периодическом перемешивании в течение 30 минут. Извлечение процеживают через несколько слоев марли, не дожидаясь охлаждения, в мерную колбу вместимостью 250 мл так, чтобы частицы сырья не попали вколбу, доводят объем раствора, если необходимо, водой до метки. Измеряют оптическую плотность 1-5 мл фильтрата, разведенного боратным буферным раствором с рН=9,0 в мерной колбевместимостью 25 мл, относительно буфера при длинах волн 275±2 нм и 305±2 нм.
Содержаниегалловой кислоты (Хгк) и танина (Хт) в пересчете на абсолютно-сухое сырье в процентах вычисляют по формулам 15 и 16:2C ГК1Е2 А 1 Е2 А 2;1221( Е1 Е2Е1 Е2 ) lХ ГКС ГК W1 W2 100;a (100 B) VaCТХТЕ1( Е111АЕ2222Е1 А 1.21Е1 Е2 ) lСТ W1 W2 100.a (100 B) Va(15)(16)Аλ1 – оптическая плотность исследуемого извлечения при длине волны 275±2 нм; Аλ2 – оптическая плотность исследуемого извлечения при длине волны 305±2 нм; а – масса сырья, г; W –потеря в массе при высушивании сырья, %; W1 и W2 – объем мерных колб, взятых для разведения, мл; Vа – объем аликвоты извлечения, взятой на анализ, мл; Е1λ1 - величина удельного показателя поглощения галловой кислоты при 275 нм; Е1λ2 - величина удельного показателя поглощения галловой кислоты при 305 нм; Е2λ1 - величина удельного показателя поглощения танинапри 275 нм; Е2λ2 - величина удельного показателя поглощения танина при 305 нм.Приготовление РСО танина: около 0,025 г (т.н.) стандартного образца танина переносили вмерную колбу объемом 50 мл, доводили водой очищенной до метки.
0,5 мл полученного разведения переносили в мерную колбу объемом 25 мл, доводили боратным буферным раствором дометки. Измеряли оптическую плотность полученного раствора относительно буфера при длинах волн 275±2 и 305±2 нм.Приготовление РСО кислоты галловой: около 0,025 г (т.н.) стандартного образца кислоты галловой переносили в мерную колбу объемом 50 мл, доводили водой очищенной до метки. 0,5 млполученного разведения переносили в мерную колбу объемом 25 мл, доводили боратным буферным раствором до метки. Измеряли оптическую плотность полученного раствора относительно буфера при длинах волн 275±2 и 305±2 нм.Метрологическая оценка разработанной методики оценка (на примере сырья крапивыдвудомной) приведена в таблице 109. Проведена валидационная оценка (на примере сырьякрапивы двудомной) разработанной методики.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
