Диссертация (1139693), страница 8
Текст из файла (страница 8)
В.Х. Василенко УКБ №2 Первого МГМУим. И.М. Сеченова обследовано 200 пациентов с подтвержденным диагнозомфункционального заболевания ЖКТ в возрасте от 18 до 65 лет.2.2.3 Характеристика контрольных группВ качестве контрольной группы 1 (КГ1) при исследовании уровняэкспрессии цитокинов и клаудинов в слизистой оболочке ЖКТ были выбраны 15пациентов с гипохромной анемией (уровень гемоглобина от 90 до 110 г/л),достоверно не отличавшихся от пациентов основной группы по полу и возрасту,не предъявлявших гастроэнтерологических жалоб [3] (Таблица 4).Таблица 4Сравнение групп пациентов СРК-Д и СРК-З, а также пациентовКГ 1 при исследовании уровня экспрессии цитокинов и клаудинов вбиоптатах слизистой оболочки ЖКТ по полу и возрастуСРК-ДСРК-ЗКГ 1Женщины91210(N, %)60,0%80,0%66,7%Мужчины635(N, %)40,0%20,0%33,3%ВозрастМе[-ДИ;+ДИ]32 [30,0; 43,3] 32 [26,4; 39,2] 36 [31,6; 42,6]p>0,05>0,05Методом секвенирования гена 16S рРНК бактерий был исследованмикробиом фекалий 21 пациента СРК (15 - СРК-Д и 6 - СРК-З);Данныеоконтрольнойгруппе–9здоровыхдобровольцах,непредъявляющих гастроэнтерологических жалоб, сопоставимых по полу и50возрасту (КГ 2) были предоставлены лабораторией молекулярной биологии игенетики НИИ физико-химической медицины (Таблица 5).Таблица 5Сравнение основной (пациенты СРК) и КГ 2 по полу и возрасту присеквенирования гена 16S рРНК бактерий в образцах фекалийСРККГ 2Женщины144(N, %)66,6%44,4%Мужчины75(N, %)33,4%55,6%35,5 [33,2; 38,9]37,0 [32,8; 41,4]Возраст (лет)Ме[-ДИ95%;+ДИ95%]p>0,05>0,05При проведении водородного дыхательного теста с лактулозой ианоректальной манометрии высокого разрешения (High Anorectal ResolutionManometry, HRAM) в качестве контрольной группы были выбраны 15 здоровыхдобровольцев, также не предъявлявшие гастроэнтерологических жалоб (КГ 3)(Таблица 6).51Таблица 6Сравнение основной (пациенты СРК) и КГ 3 по полу и возрасту припроведении водородного дыхательного теста с лактулозой и аноректальнойманометрии высокого разрешения (High Anorectal Resolution Manometry,HRAM)СРК-ДСРК-ЗКГ 3Женщины13296(N, %)41,9%87,9%40,0%Мужчины1849(N, %)58,1%12,1%60%p<0,05*Возраст (лет)Ме[-32,0 [31,6; 39,2] 38,0 [33,9; 44,2] 38,0 [34,1; 41,6]>0,05ДИ95%;+ДИ95%]* различия достигли статистически значимого уровня2.3 Методы обследованияДиагноз пациентов Группы Б устанавливался на основании исключенияорганических заболеваний ЖКТ по результатам проведенного лабораторноинструментальногообследованияисоответствияклиническойкартинызаболевания "Римским критериям III”.При обследовании больных применялись как традиционные методынепосредственного исследования (расспрос, выяснение особенностей анамнезазаболеванияианамнезажизни),такикомплекслабораторныхиинструментальных исследований.При расспросе особое внимание уделялось жалобам пациента.
Учитывалисьособенности боли, такие признаки, как локализация, интенсивность, характер,связь возникновения с нервным стрессом, приемом пищи и актом дефекации. Дляоценки интенсивности боли в животе и метеоризма применялась 10-балльнаявизуальная аналоговая шкала (ВАШ) от 1 до 10, где 10 – это наиболее сильноестрадание, приносимое ощущением боли или метеоризма из когда-либо52испытанных, а 0 – отсутствие какого бы то ни было страдания от боли илиметеоризма.Подробно оценивался характер нарушения стула, анализировались жалобыобщего порядка.Общий осмотр больного был направлен на выявление симптомов,исключающихдиагнозфункциональногозаболеванияЖКТ,такихкакгепатомегалия, спленомегалия, увеличение щитовидной железы, опухолевыеобразования толстой кишки.Увсехбольныхобязательнымсчиталосьпроведениеследующихисследований:- общий анализ крови, мочи, кала- биохимический анализ крови- УЗИ органов брюшной полости- эзофагогастродуоденоскопия с биопсией для определения НР- колоноскопия с осмотром терминального отдела тонкой кишкиПри обнаружении изменений со стороны органов дыхания, мочевыделения,эндокриннойсистемыидр.проводились необходимыедополнительныеисследования: например, выполнялось исследование гликемического профилякрови, УЗИ щитовидной железы, консультации уролога, гинеколога и другихспециалистов.Ультразвуковое исследование органов брюшной полости выполнялосьврачами отделения ультразвуковой диагностики 3/10 УКБ №2 Первого МГМУимени И.М.
Сеченова – Т.Л. Леминой (зав. отделением), С.В.Насоновой сприменением аппарата Voluson 730 фирмы «General Electric» (США). Припроведении УЗИ оценивались состояние желчного пузыря (размеры, наличиеконкрементов, толщина стенок), поджелудочной железы (наличие кальцинатов впаренхиме, изменение диаметра панкреатического протока, наличие псевдокист,увеличение размеров железы, выраженность гипоэхогенности паренхимы),размеры селезенки, печени, вне- и внутрипеченочных желчных протоков, диаметрворотной вены.53Эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС) проводилась врачами отделениялечебно-диагностической эндоскопии УКБ №2 Первого МГМУ имени И.М.Сеченова - Т.В.Антоновой (зав.
отделением) и М.Ю.Коньковым с применениемгастроскопаEG-250WR5фирмы«Fujinon»(Япония).Впроцессеэндоскопического исследования оценивалось состояние слизистой оболочкижелудка и двенадцатиперстной кишки, наличие или отсутствие эрозий и язв,характер и выраженность гастритических изменений, сопутствующие измененияпищевода. У 30 больных с синдромом раздражённого кишечника и 15 пациентамиз КГ 1 (с их согласия) была выполнена биопсия из макроскопическинеизмененных участков слизистой оболочки постбульбарного отдела 12-перстнойкишки.Колоноскопия выполнялась врачами отделения лечебно-диагностическойэндоскопии УКБ №2 - Т.В.Антоновой (зав. отделением) иМ.П.Горевым сприменением колоноскопа Exera II CLV–180 и видеомонитора Olympus OEV 191H фирмы «Olympus EVIS» (Япония).
Подготовка к проведению колоноскопиипроводилась препаратом фортранс. В день перед исследованием, начиная с 15часов, больной принимал 4 литра воды с разведённым в ней фортрансом, израсчёта 1 пакетик фортранса на 1 литр воды. При проведении исследованияоценивалось состояние слизистой оболочки толстой кишки и терминальногоотдела подвздошной кишки с целью исключения воспалительных заболеванийкишечника и новообразований. У 30 больных с СРК и 15 пациентов КГ 1 (с ихсогласия) была выполнена биопсия из макроскопически неизмененных участковслизистой оболочки дистального отдела подвздошной кишки, купола слепой исигмовидного отделов толстой кишки.В дальнейшем из группы обследованных пациентов были выделеныподгруппы больных, которым, после подписания информированного согласия,проводились дополнительные обследования для углубленного исследованияпатогенеза СРК:Морфологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатовслизистойоболочкипостбульбарногоотделадвенадцатиперстнойкишки,54дистального отдела подвздошной кишки и толстой кишки выполнялосьпрофессором кафедры патологической анатомии Первого МГМУ им.
И.М.Сеченова Е.А. Коган.В процессе эндоскопического исследования у 30 пациентов и 15добровольцев из КГ 1 были получены по 11 фрагментов слизистой оболочки: изпостбульбарного отдела двенадцатиперстной кишки (2), дистального отделаподвздошной кишки (3), купола слепой кишки (3) и сигмовидного (3) отделатолстой кишки.Проводилось гистологическое (гематоксилин и эозин, PAS-реакция) ииммуногистохимическое (ИГХ) исследование. Фиксация биоптата слизистойоболочки проводилась в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24часов с последующей заливкой в парафин. Парафиновые срезы толщиной 3–5микрон изготавливались на микротоме. Срезы фиксировались на предметныестекла, покрытые адгезивом (полилизин, APES) и инкубировались в термостатепри 370С в течение 12 часов. Далее срезы депарафинировались и обезвоживалисьв батарее из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 2-х 95% спиртов, 80% и 70%спирта и дистиллированной воды.Иммуногистохимические реакции проводились на депарафинированныхсрезах толщиной 3-4 мкм, расположенных на стеклах, покрытых APES – слоем.Неокрашенныесрезыобрабатывалисьпостандартнойметодикеиммуногистохимии с применением термической демаскировки антигенов вводяной бане.
Стекла погружались в цитратный буфер (рН 6,0) и нагревались вводяной бане при t 91 C0 в течение 15 минут. Далее стекла охлаждались прикомнатной температуре в течение 20 минут. Остывшие стекла помещались вовлажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировались 15минут с 3% раствором Н2О2. После обработки перекисью водорода стеклаополаскивались в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6), затем инкубировались с 1%раствором альбумина во влажных камерах в течение 30 минут.
По окончанииинкубации излишки альбумина снимались со стекол и на последние наносилисьпервичные антитела.55В полученных биоптатах определялся уровень и локализация экспрессииИл-2, Ил-10, TNF-α, клаудинов-2, -3 и-5. В качестве первичных антителиспользовались моноклональные антитела к Ил-2, Ил-10, TNF-α и клаудинам2,3,5 (Lab Vision, Ил-2 1: 100, Ил-10 1:100, TNF-α 1:100, клаудин 2 1:100,клаудин 3 1:100, клаудин 5 1:100).
Время инкубации с первичными антителамисоставляло 60 минут. По окончании инкубации срезы отмывались в фосфатномбуфере (рН 7,0-7,6) и обрабатывались вторичными антителами. Далее срезыинкубировались с вторичными антителами во влажных камерах в течение 30минут, затем отмывались в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6). Для метки вторичныхантител применялся авидин-биотиновый комплекс (АВК KIT, DAKO).
Длявизуализации места связывания антитела с антигеном применялась метка –фермент - пероксидаза хрена, в присутствии субстрата – Н2О2 – иколориметрическогореактивас3,3-диаминобензидином(LSAB,DakoCytomation). В результате образовывался нерастворимый в органическихрастворителях конечный продукт реакции, который визуализировался в видекоричневого окрашивания структур клеток.Далеестеклаополаскивалисьвдистиллированнойводеиядраподкрашивались гематоксилином. Затем стекла проводились по батарее издистиллированной воды, 70% спирта,80% спирта, 2-х 95% спиртов, 2-хабсолютных спиртов и 3-х ксилолов.
После чего срезы заключались всинтетическую среду с использованием покровных стекол.Результаты ИГХ оценивались по общепринятой методике в баллахколичественным и полуколичественным методами, в зависимости от процентаокрашенных клеточных ядер. Оценка интенсивности реакции проводилась по 6-тибалльной системе: 2 балла – до 20% окрашенных клеток; 4 балла – от 20% до 40%окрашенных клеток; 6 баллов – более 40% окрашенных клеток.Для клаудинов отдельно оценивалась локализация продукта реакции и егоинтенсивность: мембранное и диффузно-цитоплазматическое окрашивание.На основании полученных результатов: проводился сравнительный анализ:56экспрессии цитокинов и белков плотных контактов в зависимости отклинической картины заболевания и психоэмоционального состояния больногоградиента цитокинов и белков плотных контактов в зависимости отклинической картины заболевания и психоэмоционального состояния больного.Градиент определяли по формуле:100х(экспрессия в сигмовидной кишке/экспрессия в ДПК) – 100%Водородный дыхательный тест с лактулозой проводился с цельюисключения СИБР 31 пациенту с подтвержденным диагнозом СРК-Д и 33пациентам с СРК-З (n=64).Для определения СИБР применялся аппарат GASTROLYZER (Bedfont,Великобритания), который позволяет оценить степень ферментации углеводов(лактулозы) в тонкой кишке.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
