Диссертация (1139664), страница 9

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

Эти возбудители болезней человекадостаточномногочисленны.Посвоемучислуониуступаюттолькомикроорганизмам – возбудителям болезней человека бактериальной природы исущественно превосходят известное число возбудителей болезней человекавирусной природы.Наиболее актуальным представляется создание ПЦР-диагностикумов длявыявления трансмиссивных паразитарных болезней человека.Большая потребность существует в разработке ПЦР продуктов длядиагностикикишечныхпаразитозовчеловека,рутиннаяклассическаямикроскопическая диагностика которых либо чрезвычайно трудоемка, либонедостаточно информативна.48Чрезвычайнаяэпидемическаяопасностьводногопутипередачивозбудителей паразитарной природы стала следствием возникновения самыхмассовых водных эпидемий криптоспоридиоза и лямблиоза, связанных ссистемами коммунальных водопроводов.

Такие эпидемии нередко охватывалисотни тысяч больных. При этом полностью отсутствуют ПЦР-диагностикумы дляосуществления эпидемиологического надзора за системами водоснабжениябольших городов.Таким образом, при достаточно длительной истории использованиямолекулярно-биологических методов и средств индикации и идентификациивозбудителей болезней человека микробной природы сохраняется ряд научныхпроблем в системе применения ПЦР-диагностикумов для диагностики ипрофилактики паразитарных болезней человека.49Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕМ ИССЛЕДОВАНИЙ2.1. Материалы и объем исследований2.1.1. Источник ДНКВ качестве источника ДНК паразитов использовались пробы из банка ДНКНИИмедицинскойпаразитологииитропическоймедициныим.Е.И.Марциновского, биологический материал из специализированной КДЛ попаразитарным болезням Клинического центра Первого МГМУ им.И.М.Сеченова,препараты из специализированных центров по борьбе с паразитарнымиболезнями Республик Таджикистан, Кыргызстан, Узбекистан и Грузия.Для отработки режимов ПЦР и испытаний праймеров было использовано:20 проб криптоспоридий15 проб лямблий25 проб дирофилярий1050 проб 4-х видов малярии120 проб 2-х видов лейшманиозов10 проб бластоцистКроме того, для постановки ПЦР использовалась кровь от больных сподозрением на токсоплазмоз.2.1.1.1.

МалярияРабота проводилась с использованием ДНК, выделенной по нашейоригинальной методикеиз препаратов «толстая капля» крови, окрашенных поРомановскому-Гимза от больных трехдневной и тропической малярией, а также сДНК, выделенной из бумажных обеззоленных фильтров или нативной крови сподтвержденным наличием малярийных паразитов от тех же больных [52].Препараты крови «толстая капля» и фильтры с кровью были получены из50госпиталя погранвойск г. Душанбе (Республика Таджикистан), Центра по борьбес паразитарными заболеваниями Республики Грузия, Центра по борьбе стропическими заболеваниями Республики Таджикистан, Референс-центра помалярииНИИмедицинскойпаразитологииитропическоймедициныим.Е.И.Марциновского, Клинико-диагностического центра Первого МГМУим.И.М.Сеченова.Для микроскопического контроля проводилось изучение препаратов кровиот тех же больных.

С тем, чтобы исключить возможность перекрестных реакций,специальную группу составляли препараты крови от лихорадящих лиц сустановленным диагнозом гепатита, пиелонефрита, пневмонии, онкологическихзаболеваний.2.1.1.2. ЛейшманиозВкачествеисточникаДНКиспользоваласькультурапромастиготлейшманий, постоянно поддерживающаяся в отделе медицинской протозоологииНИИмедицинскойим.Е.И.Марциновскогопаразитологии[76].Такжебылиитропическойиспользованымедициныфиксированныепрепараты амастигот лейшманий на стеклах, ранее использовавшиеся длядиагностической микроскопии. Таким образом, в разработке участвовали всестадии жизненного цикла лейшманий: промастиготы, содержащие органеллыдвижения – жгутики из культуры лейшманий, выращенные на среде 199 иамастиготы (безжгутиковые стадии), полученные из лейшманиальных пораженийтеплокровных животных и человека [24, 25, 26, 76].2.1.1.3.

ДирофиляриозДля работы использовали ДНК дирофилярий, выделенную из крови собак, укоторых заболевание дирофиляриозом было подтверждено ветеринарнымиспециалистами. Взятие проб крови больных собак для отработки методикипостановки ПЦР производили в ветеринарных клиниках г. Москвы. Комаровпереносчиков дирофилярий собирали в разных районах Московского региона, а51также в прилегающих областях. В этом случае были исследованы микрофиляриипаразитов [76, 98].2.1.1.4. КриптоспоридиозРабота проводилась с использованием ДНК, выделенной из пробэкскрементовмолодыхтелят,содержащихооцистыпаразитов.Первыеэкскрементные пробы были взяты в совхозе «Орловский» Щелковского районаМосковской области [56]. Также сбор биоматериала осуществлялся в хозяйстве«Золотая нива» Пушкинского района Московской области. Были отобраны 26телят, возраст которых находился в диапазоне 1-3 недели.

Пробы фекалийполучалитолькооттелят,укоторыхпредварительноветеринарнымиспециалистами хозяйств «Орловский» и «Золотая нива» был поставлен иподтвержден диагноз – криптоспоридиоз. Методом стимулирования прямойкишки были взяты 26 экскрементных проб.2.1.1.5. ЛямблиозДля оптимизации ДНК диагностики лямбиоза и отработки условий реакциибыли использованы образцы кала пациентов, собранные в специализированнойклинико-диагностической лаборатории по паразитарным болезням Клиническогоцентра ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, а также в процессеобследования декретированных контингентов [56, 104, 105].2.1.1.6.

БластоцистозДля оптимизации ДНК диагностики бластоцистоза и отработки условийреакции были использованы:- культура бластоцист, поддерживавшаяся на среде Павловой, из банкапростейшихотделамедицинскойпротозоологииНИИмедицинскойпаразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского [103, 104, 105];- образцы кала пациентов, собранные в специализированной клиникодиагностической лаборатории по паразитарным болезням Клинического центраГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, а также в процессе обследованиядекретированных контингентов.522.1.2.

Аппаратура и инструментыАмплификатор типа «Терцик МС-2» со скоростью нагрева/охлажденияактивного элемента не менее 1,50 С/с.Прибор для горизонтального электрофореза типа «SubCellGTSystem» скомплектом кювет и гребенок.Источник напряжения типа «PowerPac 300» с диапазоном регулируемогонапряжения 50-300 В.Видеосистема типа «GelDoc 2000TM», предназначенная для ввода вкомпьютер, анализа и документирования изображений люминисцирующих следовДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300-400 нм,чувствительность – не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию).Холодильник бытовой электрический ГОСТ 26678Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 0С.Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения неменее 13 000 мин-1).Термостат типа «TERMO 24-15» по пробирки типа Эппендорфвместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 1200 С, количество гнезд– не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры – 0,20 С, разностьтемператур между соседними ячейками – не более 0,50 С.Аппарат для встряхивания типа «Вортекс», скорость вращения 250-3000Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W).Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности смин-1.наибольшим пределом взвешивания 200 г.

ГОСТ 24104Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН = 0,01.ГОСТ 19881-74СтерилизаторыГОСТ 19569-89Епаровыемедицинскиеилианалогичные.53Дистилятор,обеспечивающийкачестводистилированнойводы.ГОСТ 6709-72Гомогенизатор перистальтического типа «Стомайкер» или другихмоделей.Облучатель бактерицидный настенный ОБН –150 или других видов.ТУ 16-535-84Дозаторы с переменным объемом дозирования: 0,2-2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью = 1,2%; 0,5-10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью = 0,8%; 2-20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью = 0,8%; 20-200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью = 0,6%; 100-1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью = 3%; 2-10 мл с шагом 0,1 мл, с точностью = 0,5%; Пинцет медицинский.

ГОСТ 21241-892.1.3. Лабораторная посуда и материалыБумага фильтровальная лабораторная. ГОСТ 12026-76Воронки стеклянные. ГОСТ 25336-82Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические, вместимостью 25,50, 100, 200, 1000 мл. ГОСТ 12738-77Цилиндры стеклянные мерные лабораторные, вместимостью 25, 100,1000мл. ГОСТ 1770-74Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф, вместимостью 0,2; 0,5;1,5 мл.Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемомдозирования до: 10; 20; 200; 1000 мм3; 10 см3.2.1.4. РеактивыКислота соляная, хч.ГОСТ 3118-7754Кислота борная, хч.ГОСТ 9656-75Натрия гидроокись, чда.ГОСТ 4328-77Натрий хлористый, хч.ГОСТ 4233-77Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч.Гексадецилтриметиламмониум бромид (СТАВ)Корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат.

№ Н 5882Трис (оксиметил) аминометан, хч.Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА).Корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № В 4287Этидий бромистый, хч.Спирт этиловый ректификованныйСпирт изопропиловый, хч.ТУ 6-09-402-85Масло вазелиновое медицинское.ГОСТ 3164-78Хлороформ, хч.ГОСТ 20015-88Вода дистилированная.ГОСТ 6709-72Вода деионизированная.ОСТ 11.029.003-802-меркаптоэтанол, хч.ТУ 6-09-08-1024-81Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в областиТУ 6-09-11-1721-83ТУ 6-09-4292-76ТУ 6-09-13-452-75ГОСТ Р 51652-0070-720 С.

Корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № Д 1806.Буфер для ПЦР с MgCl2 . Корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № РАгароза для электрофореза (тип П). Корпорация «Сигма Алдрич»2192.(Sigma), кат. № А.6877.Маркер молекулярной массы ДНК. Корпорация «Сигма Алдрич»(Sigma), кат. № Р 1473.552.2.

Характеристики

Список файлов диссертации