Диссертация (1139664), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Значение температуры обычно располагается в интервале 45-65С;при уменьшении температуры увеличивается выход неспецифического продукта,при увеличении – уменьшается выход продукта ПЦР. Время отжига праймеровподбирают экспериментально или рассчитывают с помощью компьютерныхпрограмм. Точно подобранные температура и время отжига праймеров являютсягарантией специфичности реакции.(синтезЭлонгация праймеров - комплементарное достраивание цепей ДНКфрагментаформируютилистартовыеполимеризация).блоки,сПрисоединившиесякоторыхКомплементарное достраивание нитейначинаетсяпраймерысинтезДНК.ДНК всегда протекает только внаправлении от 5’- конца к 3’- концу нити ДНК и происходит в противоположныхдруг другу направлениях.
При построении молекулы ДНК in vitro длянаращивания нуклеотидной цепи используют дезоксинуклеозидфосфат (дНТФ).Каждому нуклеотиду соответствует свой дНТФ: аденину - дАТФ, гуанину дГТФ, тимину - дТТФ и цитозину - дЦТФ.Элонгация протекает при температуре 72С. При данной температуреоптимально работает фермент Taq-полимераза, катализирующий построениеновой нуклеотидной нити. Время элонгации может варьировать в зависимости отдлины ожидаемого фрагмента ДНК.
В современных методиках используют Taqполимеразу, выделенную из термостабильной бактерии Termus aquaticus,42живущей в горячих источниках. Этот фермент высоко стабилен и сохраняетактивность до конца процесса амплификации. Ранее в ПЦР использовалинетермостабильные ДНК-полимеразы. Это требовало добавления новых порцийфермента после каждого цикла денатурации ДНК. Taq-полимераза вводится вреакционную смесь однократно.По окончании каждого цикла ПЦР количество определяемых участков ДНКв реакционной смеси увеличивается в 2 раза.
Так, например, по окончании 30циклов ПЦР из одной молекулы ДНК-мишени образуется 230 копий (1073741824копий) этой молекулы, т.е если повторяется n циклов - количество фрагментовДНК будет составлять 2 n . Возможность получить большое количество копийопределяемых участков ДНК обусловливает высокую чувствительность ПЦР.1.5.1. Классическая ПЦРДлявидоспецифическойкомплементарныедиагностикиконсервативномуучасткуиспользуютсяДНКпаразитапраймеры,сизвестнойпоследовательностью нуклеотидов.
Наиболее надежным является метод ПЦР стак называемыми «вложенными» праймерами (nested-PCR) (рисунок 1.5.1.1.).Участок ДНК, амплифицированныйс первой парой праймеровПовторнаяамплификацияпродукта ПЦРАмплификация со второйпарой праймеровПродукт ПЦР, выявляемый электрофорезомРисунок 1.5.1.1. ПЦР с «вложенными» праймерами43Такой метод предполагает использование двух пар праймеров. Первая параамплифицируетдостаточнобольшойучастокДНК,которыйзатемамплифицируется со второй парой праймеров. Это позволяет значительноповысить специфичность реакции и избежать гипердиагностики.
Метод nestedPCR необходим при использовании в качестве источника ДНК капель крови,собранных на фильтры, так как в этом случае невозможна полная очистка ДНКпаразита от ДНК хозяина и внешних контаминантов. Основной недостаток этогометода в том, что амплификацию необходимо повторять дважды, что требует вдва раза больше времени и реактивов.Избежать этих недостатков можно путем подбора высокоспецифичныхпраймеров, амплифицирующих только искомую ДНК.1.5.2. ПЦР в реальном времениВ начале 90-х годов XX века было предложено регистрировать накоплениепродукта ПЦР в ходе реакции.
Изобретение метода флуоресцентной детекциирезультатов ПЦР дало начало новому направлению в ПЦР-диагностике – ПЦР «вреальномвремени».Появлениеновойметодикипозволилопроводитьколичественный анализ, а также снизить число ложноположительных результатовза счет отсутствия фазы электрофореза – самой «грязной» фазы ПЦР [117, 171,180, 181, 186]. Кроме того, флуоресцентные методы позволяют избирательнорегистрировать амплификацию определенных фрагментов ДНК, повышая темсамым достоверность исследования. Флуресцентная детекция результата ПЦРвозможна как по конечной точке с помощью специального оборудования, так и впроцессе реакции – «в реальном времени». При регистрации результатовамплификации в течение всего процесса исследователь получает намного большеинформации об особенностях течения реакции.
В настоящее время техникапостановки ПЦР «в реальном времени» значительно проще, чем при классическойПЦР [77, 160, 162, 182, 194].441.6. Перспективы применения методов молекулярной паразитологииОднимизперспективныхнаправленийприменениямолекулярно-биологических методов в паразитологии является иммуногенетика, основнойзадачей которой является изучение генетических основ иммунного ответачеловека. Применение иммуногенетических методов позволит уточнить механизмлекарственной устойчивости возбудителей паразитарных заболеваний, в первуюочередь малярии, к применяемым химиотерапевтическим препаратам.Взрывное развитие молекулярной биологии и иммунологии, появлениемолекулярной медицины оказало заметное воздействие на понимание паразитохозяинныхотношенийиспособоввыживанияпаразитов-прокариотвнеблагоприятных условиях среды организма хозяина, а также на механизмыпатогенеза многих инфекционных и отдельных паразитарных болезней человека[89].Изучение паразито-хозяинных отношений представляет не только узкопрофессиональный медицинский интерес.
Паразитизм – это вид межвидовойконкуренции, приносящий пользу популяции паразита. По своей сути паразитизмотносится к таким сложнейшим биологическим понятиям, как ген, популяция,окружающая среда. Явление паразитизма зарождается в результате поведенческихконтактов между разными формами живых существ. Оно не возникает внезапно, аразвивается на протяжении многих поколений по мере адаптации однихорганизмов к условиям существования на поверхности или внутри других живыхформ. Становление паразитизма означает преодоление сопротивления, которымобладает любая особь и даже клетка, обеспечивающего предотвращениепроникновения внутрь посторонних живых сущностей. В процессе такогопреодоления происходит взаимная адаптация и формируется уникальнаябиологическая система – «паразит-хозяин».
Неизвестно ни одной группы илиформы, которую можно было бы квалифицировать, как отошедшую отпаразитизма и вернувшуюся к свободному образу жизни, в силу «невыгодности»такого отхода с точки зрения «экономики организма». Поэтому в свете45эволюционного учения паразитизм является наиболее прогрессивной формойсуществования. При этом паразит оказывает выраженное воздействие на организмхозяина [89, 90].Практически универсальным следствием воздействия паразита на организмхозяина является развитие иммуносупрессии. Известно, что в системе клеточногоиммунитета регистрируются два взаимоисключающих ответа со стороныиммунокомпетентных лимфоцитов - Т-хелперов: Тх1 (Th1) и Тх2 (Th2) типыответа. Каждый из указанных вариантов ответа характеризуется своим наборомпродуцируемых цитокинов – интерлейкинов (IL) и интерферонов (INF).Вреальной жизни невозможно наблюдать изолированные проявления Th1 и Th2типов иммунного ответа. Всегда в организме больного присутствуют элементыобоихтиповиммунногоответа.Однаковэтойсмесинаблюдаетсяпревалирование того или иного варианта.
Как правило, преобладание Th1 типаиммунного ответа ассоциируется с острым течение инфекции и последующимвыздоровлением, а Th2 тип – с хронизацией инфекционного процесса иаллергическими проявлениями.Гельминтозы являются хорошо воспроизводимым индуктором Th2 типаиммунного ответа. Пусковыми механизмами стимулирования активации Th2ответа при гельминтозах являются растворимые метаболиты и компонентымембраны (кутикулы или тегумента) инвазионных или мигрирующих личинок ивзрослыхстадийпаразита.Полагают,чтоантигеныгельминтовпривзаимодействии с CD4+ клетками человека преимущественно стимулируютпродукцию цитокинов, регулирующих Th2 тип иммунного ответа - IL4, IL5 иIL10. последний выступает как прямой антагонист INFγ [9, 19, 117].Присутствиетканевыхпаразитоввызываетстольвыраженнуюиммуносупрессию, что не происходит отторжения кожных аллотрансплантатов улабораторныхэкспериментыгрызунов,былиинвазированныхвыполненытрихинеллами.сотрудникамиВпервыеНИИМПиТМэтиим.Е.И.Марциновского.
Было показано, что трихинеллезная инфекция не приводит к46общемуподавлениюиммунореактивности.Костныймозглабораторныхгрызунов, пораженных трихинеллезом, более эффективно защищает облученныхживотных, а реакция «трансплантат против хозяина» у них выражена слабее.Впоследствии за рубежом при повторении этих экспериментов были полученыидентичныерезультаты.иммуносупрессирующимВдополнениедействиембылопомимопоказано,трихинеллчтоподобнымобладаютдругиегельминты и, в частности – Nippostrongilus braziliensis.
Кроме задержкиотторжениякожногоаллотрансплантатабылозафиксированоболеепродолжительное функционирование трансплантированной почки – 32 дняпротив 10 в контроле [78, 206].Наиболее частым патогенным проявлением паразитирования в организмечеловекагельминтовипатогенныхпростейшихявляется,помимоиммуносупрессии, аллергизация. Было показано, что экспансия популяциицитокинов Th2 в ответ на аллергены возникает только у индивидуумов с HLA-Dгаплотипом и способностью к независимой от HLA гиперпродукции IgE.Аллергический фенотип формирует ряд генов на хромосоме 11q, 5q и кластергенов на хромосоме 11q13.
С другой стороны, чрезмерная иммуносупрессияпаразитарной природы может, в конечном счете, приводить к торможениюаллергических проявлений на другие аллергены. При этом происходит полноевыключение ответа со стороны Т-системы иммунитета на любые антигены,включая антигены самого возбудителя паразитарного заболевания.В настоящее время методы молекулярно-биологической диагностики нашлиширокое применение в области инфекционной патологии. Стали рутиннымиметоды диагностики ВИЧ/СПИД, гепатитов, кори, дифтерии и других социальнозначимых инфекционных заболеваний с помощью ПЦР. Большое число наборовдля ПЦР диагностики имеется на рынке. При этом изготовлением и реализациейтаких ПЦР наборов занимается большое количество как отечественных, так изарубежных фирм-производителей.
Совершенно другая ситуация сложилась вобласти диагностики паразитарных болезней человека. Число имеющихся47готовых наборов для ПЦР-диагностики паразитарных болезней невелико.Предлагаемые наборы согласно прилагаемым инструкциям применимы толькопри единичных нозологических формах. Отсутствует какая-либо системность всоздании ПЦР-диагностикумов паразитарных болезней. Представляется явнослучайный выбор того или иного паразита-эукариота как объекта длямолекулярно-биологической индикации и идентификации.Часто предлагаемые на рынке тест-системы для ПЦР-диагностикипаразитарных болезней путем исследования крови не учитывают ни особенностижизненного цикла паразитов-эукариотов, который гораздо более сложен, чеманалогичный цикл развития паразитов-прокариот.
Более того такие тест-системыдляПЦР-диагностикиконкретнойотдельныхпаразитарнойпаразитозовболезни.Принемногихучитываютпатогенезпаразитозахпаразитыотсутствуют в периферической крови, а локализуются в органах и тканях, откудаони не способны проникать в кровоток. Поэтому попытки использования ПЦР длявыявления таких возбудителей теоретически обречены на неудачу и практическибудут постоянно давать ложноотрицательные результаты на фоне положительныхсерологических реакций [54, 56, 58].ВнастоящеевремяотсутствуетсистемаПЦР-диагностикивсегомногообразия паразитарной патологии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
