Диссертация (1139664), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Это не отражает истинной ситуации, т.к. дирофиляриоз не входит в числопаразитозов, подлежащих официальной регистрации [1, 2, 8, 98].Границыраспространениядирофиляриозовопределяютсяареаламикомаров-переносчиков и количеством тепла, необходимого для развития комарови возбудителей в них (пороговой для личинок дирофилярий является 14 0С). ВрезультатерайонированиятерриторииРоссиибыливыделены3зоныпотенциального риска заражения дирофиляриями: низкого, умеренного и70устойчивого. Ареал дирофиляриозов в России занимает территорию от 410с.ш. до580с.ш., где среднесуточные температуры июля составляют от 17,5 0С на севере до240С и выше на юге.
В таких условиях сезон передачи через комаров длится 2-2,5мес. на севере и 3-4 мес. на юге. Кроме того, распространение этой зоонознойинвазии осуществляют подвижные домашние и дикие животные [2]. Сведения обареалах дирофиляриозов необходимы для экологического, энтомологического иэпидемиологическоговидовмониторингавсистемеэпиднадзоразатрансмиссивными болезнями [99, 130, 156].Для диагностики дирофиляриозов применяют полимеразную цепнуюреакцию [3].
D. repens имеет повторяющиеся участки ДНК, а D. immitisкутикулярный антиген, которые могут быть использованы для диагностики этихвидов дирофилярий. Метод ПЦР позволяет идентифицировать особи гельминтовв очагах, где одновременно распространены разные виды дирофилярий [209].Нами были выбраны и синтезированы праймеры для диагностики D. repensи D. immitis и подобраны режимы амплификации для этих праймеров (таблица3.4.1.) [76]. Испытания метода ПЦР диагностики дирофиляриозов проводилось насыворотках крови собак с установленным диагнозом. Было проверено 10положительных и 30 отрицательных сывороток.
Полученные данные показали100% эффективность и чувствительность метода.СтадияТаблица 3.4.1Оптимизированные режимы амплификацииD.repensD.immitisНачальная денатурация94С – 5 мин94С – 5 минДенатурация94С – 30 сек94С – 1 минОтжиг праймеров50С – 30 сек50С – 2 минУдлинение72С – 1 мин72С – 3 минКонечное удлинение72С – 5 мин72С – 5 мин3030Количество цикловамплификации71Визуализация продукта ПЦР проводилась в 1,5 % агарозном геле,окрашенном бромистым этидием.При оценке результата ПЦР ожидаемый размер продукта (относительномаркера) для D. repens составил в.
р., для D. immitis - в. р.Для идентификации D. repens использовали праймеры:DIR3: F - 5' – CCGGTAGACCATGGCATTAT - 3'DIR-4: R - 5' – CGGTCTTGGACGTTTGGTTA - 3'Для идентификации D. immitis использовали праймеры:COI intF - 5' –TGATTGGTGGTTTTGGTAA - 3'COI intR 5' – ATAAGTACGAGTATCAATATC -3'.Также была отработана методика постановки ПЦР с использованием ДНК,выделенной из комаров родов Culex, Anopheles и Aedes.3.5. Обнаружение возбудителей паразитозов в переносчикеНовым важным для задач эпидемиологического надзора за паразитарнымиболезнями направлений наших исследований стала разработка методологииопределения уровня зараженности членистоногих – переносчиков возбудителейинфекционных и паразитарных болезней.
Этот подход позволяет получатьконкретные объективные данные инфицированности переносчиков патогеннымиагентами и рассчитывать реальный риск заражения людей в результатетрансмиссивной передачи возбудителя на обследуемых конкретных территориях[7, 13, 22, 33, 81, 109].Наши исследования в НИИ медицинской паразитологии и тропическоймедицины им. Е.И. Марциновского проводились на протяжении последних 10 лет.Целью указанных научных разработок стала оптимизация методики выявленияналичия патогенных агентов в теле членистоногих – переносчиков, ранее эти целидостигались за счет ненадежных методов микроскопической визуализациипатогенов в препаратах, приготовленных из свежеполученных членистоногих, неподвергшихся процессу высыхания.
Высохший материал для микроскопического72исследования оказался не пригоден.В наших исследованиях мы основывались на выделении фрагментов ДНК,позволявших проводить достоверную индикацию и идентификацию возбудителейтрансмиссивных паразитарных заболеваний в переносчике.В качестве первого объекта для наших исследований были использованыпереносчики возбудителей дирофиляриозов. Для этой цели нами былиподвергнуты исследованию комары родов Culex, Anopheles и Aedes, отловленных«методом на себя» или эксгаустером в местах дневок в Московской, Тверской иНижегородской областях (с 2008 по 2011 гг.) [76].В качестве праймера для постановки ПЦР с материалом, полученным изкомаров – переносчиков дирофилярий, мы использовали тот же праймер (ту жегенетическую последовательность, что и для разработанной нами диагностикидирофиляриозов у людей).В результате исследования было выявлено 116 самок комаров, зараженныхличиночными стадиями дирофилярий, в том числе 28 самок Culex, 10 самокAnopheles и 78 самок Aedes.
Как было показано использование генетическойпоследовательности праймера, полученного на основании изучения геномавзрослого паразита Dirofilaria repens, оказалось пригодным для выявления иидентификации присутствия личиночной стадии того же паразита. Эти данныееще раз подтверждают сохранение полного генома паразита на протяжении всегожизненного цикла, включающего полную трансформацию организма паразита вразличные стадии на протяжении прохождения всего жизненного цикла.Для исследования в ПЦР мы использовали материал, полученный изотловленных комаров.
Насекомые гомогенизировались, после чего проводилосьвыделение ДНК по стандартным протоколам для наборов, предусматривающихразрущение хитиновых оболочек.Достоверностьличиночнымиопределениястадиямимикроскопическимзараженностидирофилярийисследованием.комаров–переносчиковбыла дополнительноподтвержденаМикроскопиюраздавленного73насекомогопроводилидотогокакуказанныйматериалвпоследствиииспользовался в ПЦР.Другим объектом нашего исследования стали клещи – переносчикивозбудителя клещевого боррелиоза.
Клещевой боррелиоз или болезнь Лайма –группа природно-антропургических, трансмиссивных, зоонозных инфекций,вызываемыхразличнымивидамиборрелий.Заболеваниехарактеризуетсясклонностью к хроническому и латентному течению, с преимущественнымпоражением кожи, опорно-двигательного аппарата, нервной системы на фонеинтоксикации, лихорадки и полисистемного поражения различных органов.В сезон активного нападения клещей, присасывание этих членистоногихвызывает большое число обращений пострадавших лиц в различные лечебнопрофилактические учреждения за медицинской помощью.
Пик обращенийнаблюдается в весенне-летний период года [43, 67, 72].Важнейшимкритериемоказанияквалифицированноймедицинской помощи лицам, подвергшимся нападениюадекватнойклещей, служитдостоверное определение зараженности клеща, то есть наличие в организмечленистоногого возбудителей клещевого боррелиоза – Borrelia spp.Дляопределенияотрабатывалиналичиявозможностьвозбудителяиспользованияворганизмесодержимогоклещеймыорганизмачленистоногого для молекулярно генетического исследования. В связи с тем, чтов настоящее время на рынке медико-биологических препаратов существуетбольшое число наборов для ПЦР диагностики клещевого боррелиоза у людей,основным направлением наших исследований стад подбор оптимальной системыдлявыделенияДНКпаразитаизвысушенных,либозаспиртованныхособейчленистоногих – переносчиков клещевого боррелиоза.Былоиспытано12различныхкоммерческихнаборовразличныхпроизводителей. Было проведено более 500 исследований с различнымикоммерческими наборами.
В каждом случае мы определяли количество (объем)выделенной ДНК возбудителя.74В результате предпочтение было отдано набору «Проба-ГС» (ДНКтехнология, Россия). Несмотря на самую сложную из всех испытываемых наборовметодикувыделения,данныйнаборпозволяетвыделитьмаксимальноеколичество ДНК из всех проб, взятых для анализа.Экспериментальныеработыпроводилинаклещах,зараженныхвозбудителем болезни Лайма – Borrelia burgdorferi. Аналогичную разработаннуюнами методику мы применяли и для оценки зараженности комаров возбудителямидирофиляриоза и малярии [83, 84].В дальнейшем методику, отработанную на экспериментальных материалах сзараженнымиклещами,мысуспехомприменялидляисследованиядиагностического материала, поступавшего из клинико-диагностического центраПервого МГМУ им И.М. Сеченова.
Всего за 2008-2012 гг. было исследовано 148клещей, которые приносили пострадавшие от нападения членистоногих,обратившиеся за медицинской помощью в отделение медицинской паразитологиии тропической медицины КДЦ КЦ ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.СеченоваМинздрава России. Среди исследованных членистоногих 54 экземпляров клещейоказались зараженными Borrelia burgdorferi.Предложенныйнамиподходкопределениюобъективногоуровнязараженности членистоногих – переносчиков патогенами – возбудителямиинфекционных и паразитарных болезней является важным компонентомопределения уровня и степени различных биологических угроз на территориинашей страны и расчета реальных рисков заражения людей возбудителямиразличных трансмиссивных инфекционных и паразитарных болезней во времяпребывания на эндемичных территориях.Проведенные исследования показали возможность использования данногонабора для оценки зараженности членистоногих возбудителями трансмиссивныхпаразитарных и тропических болезней.75Глава 4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
