Диссертация (1139664), страница 7

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

Современный эффективный эпиднадзордолжен включать не только систему изучения динамики инфекционной ипаразитарной заболеваемости, возрастного, полового и профессиональногосостава заболевших, особенностей биологии и экологии возбудителя инфекции ипутей и условий его передачи, что полностью определяется термином«Мониторинг».Неотъемлемойсоставнойчастьюэпиднадзораявляетсяпланирование и осуществление конкретных мер, направленных на снижениезаболеваемости или ликвидацию эпидемического характера распространенияболезни.

Важными элементами эпиднадзора, обеспечивающими его постоянноесовершенствование, должны являться изучение эффективности действующихпрофилактических и противоэпидемических мероприятий или их систем,исследования, направленные на усовершенствование этих мероприятий, ипериодическая корректировка их на основе полученных результатов, а такженовейших данных смежных разделов науки и опыта, накапливаемого службамиэпиднадзора в различных странах и обобщаемого на международном уровне [90].Для ряда паразитарных болезней, например, болезнь Шагаса, характерноприсутствие возбудителя в крови в начале развития заболевания. Только в первыеодин-двамесяцатеоретическивозможнообнаружитьтрипаносомыприисследовании крови, особенно если такое исследование проводится на фонеразвившегося лихорадочного пароксизма.

В дальнейшем возбудитель на многиегоды исчезает из кровотока. При классическом развитии американского35трипаносомоза антитела появляются только через несколько месяцев послестихания острых проявлений болезни Шагаса [114, 131, 165,195].Теоретически существенным облегчением ранней диагностики болезниШагаса, ответственной за тяжелый экономический ущерб и появление миллионовинвалидов, из-за развивающейся кардиопатии и мега-органов, может стать ПЦРдиагностика. Это только один из возможных примеров, имеющейся ниши в сфереиспользования ПЦР-диагностики в области паразитарной патологии человека.1.3.1. Виды мониторинга в системе эпидемиологического надзораСоставной частью системы эпиднадзора в России является мониторинг,включающий 5 видов: метеорологический, экологический, энтомологический,социально-демографический и эпидемиологический [34, 73].Метеорологический мониторинг проводится для определения:сроковначалаиокончаниясезонаэффективнойзаражаемостипереносчиков – комаров Aedes, Culex, Anopheles (при дирофиляриозах) илиAnopheles (при малярии);определения времени возможности появления первого случая заражениячеловека в данном году и последнего, т.е.

длительности сезона передачивозбудителей по данным метеостанций о среднесуточных температурах воздуха;числа оборотов инвазии в течение сезона передачи.Экологический мониторинг отражает влияние окружающей среды нараспространение трансмиссивных инфекций и динамику их ареалов. При этомучитывают:ландшафты, способствующие «восприимчивости» территории дляданной инфекции;хозяйственную деятельность местного населения;степень контакта комаров с человеком (при малярии) или с животными(при дирофиляриозах);36природныекатаклизмы(потеплениеклимата,засуха,паводки,наводнения).Энтомологический мониторинг необходим для постоянных наблюденийза переносчиками в природных условиях.

Он включает:мониторинг численности преимагинальных фаз развития переносчика(яйцо, личинка, куколка);мониторинг численности взрослых комаров Anopheles;учёт численности переносчиков, нападающих на человека;определение степени контакта комаров с человеком;заражённость переносчиков возбудителями - ксеномониторинг;учёт динамики мест выплода переносчиков;изучение суточной динамики нападения комаров на человека;определениераздражимостиирезистентностипереносчиковкприменяемым инсектицидам.Эпидемиологический мониторинг проводят для:эпидемиологического надзора за населением;оценки эпидемиологической ситуации в реальном времени;эпидемиологической диагностики (эпидемиологического обследованияслучаев и очагов, наблюдения за ними);районирования территории по степени опасности для населения [59].Социально-демографический мониторинг включает:определение групп повышенного риска заражения;установление типов миграций населения (бытовые, профессиональные,беженцы, переселенцы);сбор информации о численности, возрастном и половом составенаселения;37выяснение отношения населения к проводимым профилактическиммероприятиям (анкетирование).Молекулярно-генетические исследования находят применение во всехуказанных направлениях мониторинга за паразитозами, кроме первого.

Наиболееважную роль ДНК-диагностика играет в экологическом, энтомологическом иэпидемиологическомвидахмониторинга,гдепроводитсяизучениефункционирования паразитарных систем трансмиссивных и нетрансмиссивныхинфекций в различных условиях внешней среды, что будет показано в 3, 4 и 5главах диссертации.1.4. Современные методы диагностики паразитозовДиагностикапаразитарныхболезнейосновываетсянавыявлениипростейших, яиц и личинок гельминтовчасто микроскопическими методами. Взависимости от локализации возбудителя материалом для исследования могутбыть кровь, мокрота, фекалии, образцы тканей (биоптаты), спинномозговаяжидкость, костный мозг и др. [170]. Иногда прибегают к культивированию наспециальныхсредахилипутемпассажейналабораторныхживотных(биологическая проба).

B последние годы расширился спектр иммунологическихметодов диагностики паразитозов [192]. При некоторых паразитарных болезняхиспользуют метод ПЦР для идентификации ДНК паразита в биологическихматериалах [53, 54, 72, 78, 169].В настоящее время ПЦР применяется при следующих паразитозах:Малярия (научные исследования)Лейшманиозы (рутинная диагностика и научные исследования)Токсоплазмоз (в основном рутинная диагностика)Дирофиляриозы(эпидемиологическиеиэнтомологическиеисследования)Простейшие кишечника (анализ водопроводной и питьевой воды,рутинная диагностика)38Ограничения применения ПЦР при рутинной диагностике паразитозовсвязаны со сложным жизненным циклом паразитов, когда паразит на разныхстадиях жизненного цикла изменяет свою локализацию в организме хозяина иневозможно определить, какой материал оптимально брать для исследования [56].Внедрение метода ПЦР в широкую практику стало одним из наиболееважных событий в биологии и медицине в последнее десятилетие.

Метод ПЦРставитдиагностикунапринципиальноинойуровень–определенияспецифических нуклеиновых кислот – ДНК или РНК, что позволяет провестипрямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации [56].С помощью ПЦР одна молекула искомой ДНК может быть обнаружена вприсутствии миллионов других молекул ДНК в исследуемом материале [28, 31,58, 102, 118].Идея открытия метода ПЦР принадлежит К.Б.Мюллису, сотрудникукорпорации «Цетус». В 1983 году он разработал метод, благодаря которому invitro можно было получать копии изучаемых генов в неограниченном количестве.Этот метод, основанный на амплификации искомого участка ДНК, он назвалполимеразной цепной реакцией (ПЦР).

В скором будущем, новый метод сталоднимизнаиболеесовершенныхсредидругихметодовмолекулярно-биологических исследований [56].До изобретения ПЦР и других методов амплификации нуклеиновых кислот(например,лигазнаяцепнаяреакция)длягенетическихисследованийиспользовали ДНК-зондовую детекцию, основанную на гибридизации меченыхрадиоактивным изотопом или флуоресцентным веществом специфическихолигонуклеотидныхзондовсвыделеннойДНК.ОднакоДНК-зондоваядиагностика имеет существенные ограничения как по своей чувствительности, таки по трудоемкости и длительности исследования: для ее осуществлениянеобходимо выделить интактную ДНК из не менее чем 10000 клеток, а сампроцесс гибридизации не может быть полностью автоматизирован [111, 122, 126].ПЦР представляет собой процесс, протекающий в одной пробирке и39состоящий из повторных циклов амплификации (размножения, копирования)специфической последовательности молекулыДНК, с целью получениядостаточно большого числа копий, которые могут быть выявлены обычнымиметодами детекции, например, электрофорезом.Со временем появились модификации ПЦР, позволившие оптимизироватьреакцию и снизить число случаев гипо- и гипердиагностики.

К такиммодификациям относятся: ПЦР с вложенными праймерами (nested-PCR), ПЦР вреальном времени, мультиплексная ПЦР. В последнее время большое вниманиеуделяется разработке биочипов, в основе которых также лежит метод ПЦР.Основные области применения метода ПЦР в медицине - это диагностика,мониторинг лечения и профилактика инфекционных заболеваний разнойэтиологии,наследственныхионкологическихболезнейирядадругихпатологических состояний [18, 91, 150, 167, 187].Благодаря использованию ПЦР и прямому секвенированию (установлениюнуклеотидной последовательности) продуктов ПЦР, значительно упростилсяпоиск мутаций и маркеров генетического полиморфизма. Молекулярный анализнуклеиновых кислот позволяет обнаружить специфические нарушения в генах,оценивать их влияние на экспрессию генов и физиологию клетки.Большой интерес для изучения межштаммовых различий представляютметоды, не требующие знания ДНК-последовательности: RAPD-PCR (randomlyamplified polymorphic DNA) – «случайно амплифицируемая полиморфная ДНК» иУП-ПЦР – ПЦР с универсальными праймерами.

В этих методах используютсяпраймеры не направленные на какой-либо ген: RAPD-PCR (длина праймеров 10нуклеотидов) и УП-ПЦР (длина праймеров в среднем 16 нуклеотидов).Существуют также менее распространенная техника AP-PCR (arbitrary primedpolymerase chain reaction) – ПЦР с произвольными праймерами (длина праймеровболее 15 нуклеотидов). Такие праймеры синтезированы на определенныепоследовательности различных объектов, но используются на другом объекте.ПриDAF-PCR(DNAamplificationfingerprinting)используютсятакже40произвольные праймеры, но более короткие, в сравнении с АП-ПЦР (5нуклеотидов и более).Однако все вышеперечисленные методы являются лишь косвеннымдоказательством межштаммовых различий и только применение прямогосеквенирования,позволяющегоустановитьточнуюнуклеотиднуюпоследовательность вариабельных участков генома, может точно показатьлокализацию этих различий [28, 48].1.5.

Методологические принципы ПЦРНезависимо от модификации метод ПЦР состоит из трех основных этапов:выделение ДНК, ПЦР собственно (амплификация) и детекция продукта ПЦР(амплифицированной ДНК) [14, 18, 19, 28, 31, 119].ПЦР представляет собой циклический процесс, проводимый в однойпробиркевспециальномпрограммируемомтермостате,называемомамплификатор или термоциклер, который автоматически меняет температуру ивремя в соответствии с заложенной программой [14, 19, 28, 31, 113].Процесс амплификации состоит из трех последовательных стадий:денатурации, отжига праймеров и элонгации(достройки праймеров),повторяющихся 25-35 раз.Денатурация - плавление двухцепочной молекулы ДНК на двеолигонуклеотидные нити, необходимое для присоединенияпраймеров копределяемому участку ДНК; температура - 95С; время - 1 мин.Праймеры – короткие одноцепочные ДНК, состоящие из 20 - 30дезоксиолигонуклеотидов, комплементарных 3’ концам цепей копируемой ДНКматрицы.

Праймеры ограничивают фрагмент ДНК, который будет миллион разскопирован на стадии элонгации.Отжигпраймеров-комплементарноеприсоединениексоответствующим последовательностям специфического фрагмента ДНК напротивоположных концах каждой из нитей; температура отжига зависит от41структуры праймеров (соотношения нуклеотидов в цепи ДНК) [104, 105] ирассчитывается по формуле:Tm = 22 +1.46 ([2 x (G+C)] + (A+T))где:Tm - оптимальная температура для присоединения праймеров.G+C - количество G (гуанина) и С (цитозина) в структуре праймеров.A+T - количество А (аденина) и Т (тимина) в структуре праймеров.Существуеттакжерядкомпьютерныхпрограмм,рассчитывающихоптимальную температуру для присоединения праймера к комплементарномуучастку ДНК.

Характеристики

Список файлов диссертации