Диссертация (1139664), страница 10

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

Методы исследований2.2.1. Выделение ДНКВыделениеДНКпроводилосьспомощьюстандартныхнаборовпроизводства компании Биоком (Россия) и ДНК-технология (Россия) поприлагаемым инструкциям. Использовались следующие наборы реагентов:Проба-рапид, Проба-ГС, Проба-НК.2.2.2. Постановка ПЦРДля постановки ПЦР использовались готовые ПЦР смеси ПЦР-ядро(Биоком, Россия), а также наборы реагентов для постановки ПЦР без праймеров(Ампли-сенс, Россия).Для визуализации результатов ПЦР проводили электрофорез в 1,5%агарозном геле [7]. Для визуализации результатов электрофореза в гель добавлялибромистый этидий (EtBr) до концентрации 0,5 мкг/мл. Для приготовления геля ипроведения электрофореза использовали 1хТАЕ буфер (0,04 М Трис-ацетат, 2 ммЭДТА, рН 8,0).

Перед нанесением на гель пробы смешивали с утяжеляющимраствором, содержащим 0,25% бромфенолового синего, 35% глицерина, 50 мМЭДТА. Электрофорез проводили при напряженности поля от 2 до 15 В/cм икомнатной температуре. Полосы нуклеиновых кислот в геле идентифицировали вУФ с длиной волны 254 нм и фотографировали с помощью цифровой камерыKodak Digital Camera на приборе Kodak EDAS 290. Фотографии анализировали спомощью программы AdobePhotoshopCS, Version 8.0.2.2.3. Реактивы и оборудование для постановки ПЦРРеакционнаясмесь«Ампли-Сенс-200-1»(ФГУЦНИИЭРоспотребнадзора):Смесь нуклеотидтрифосфатов, 1,76 мМ dNTP-mix5-х ПЦР-буфер (без Mg++)MgSO4Деионизированная вода, стерильная, автоклавированная, H2OMilliQ56Taq – полимеразаМинеральное масло вазелиновоеСмесь праймеров по 2 мкл каждогоКоличество ингредиентов на 10 пробирок в зависимости от объемареакционной смеси приведено в таблице 2.2.3.1.Таблица 2.2.3.1Состав и объемы ингредиентов ПЦРРеактивы№пОбъемОбъемреакционнойреакционнойсмеси 300 мклсмеси 500 мклп1Деионизированная вода190 мкл322 мкл2Буфер для полимеразной30 мкл50 мкл12цепной реакции с Mg (10 х)3Смесь нуклеотидов30 мкл50 мкл4Праймер 1 (5 пМ/мкл)20 мкл30 мкл5Праймер 2 (5 пМ/мкл )20 мкл30 мкл6Taq-полимераза (5 ед/мкл)10 мкл18 мкл3456Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб,но не меньше чем на 5.Реакционная смесь компании Биоком:ПЦР – ядро – 5 мкл;Смесь растворителя – 10 мкл;57ДНК – 0,3-0,5 мкл;Масло для ПЦР.Общие требования к постановке идентификационной ПЦР.

При проведенииидентификации обязательно готовят следующие пробы: ДНК – матрица положительного контроля с праймерами ксоответствующим возбудителям;ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к соответствующимвозбудителям; ДНК-матрица отрицательного контроля с теми же праймерами исследуемые образцы ДНК-мишени с праймерами.2.2.4. Определение порога чувствительности ПЦРОпределение порога чувствительности проводилось методом серийныхразведений исходной ДНК. Применялись разведения 1:5, 1:10, 1:50 и 1:100.Предварительномикроскопическимметодомподсчитывалоськоличествопаразитов в пробе.Условия проведения полимеразной цепной реакцииДлярезультатовпредупрежденияПЦРложноположительныхсоблюдалиразработанныеиложноотрицательныхспециальныетребованиякпланировке, режиму работы ПЦР-диагностической лаборатории [105].1.

На стадии обработки клинического материала и приготовленияреакционной смеси использовали только одноразовые наконечники и пробирки.2. Не допускали использования одних и тех же наконечников приобработке различных образцов клинического материала.3. Не использовали одни и те же наконечники при внесении различныхпроб в амплификационную смесь.584. Операции «обработка клинического материала», «сборка реакционнойсмеси» и «электрофорез» проводили в раздельных помещениях или в тщательноизолированных зонах.5. Каждая рабочая зона была снабжена собственными комплектамиавтоматических пипеток, пластиковой и стеклянной посудой, штативами,халатами и прочими принадлежностями.6.

Инструменты, приборы, материалы из зоны обработки клиническогоматериала не переносили в зону сборки реакционной смеси, а также изпомещения для электрофореза в любую другую зону, во избежание контаминациипомещений продуктами амплификации или ДНК искомого микроорганизма.7. В нерабочее время проводили облучение помещений УФ-светом.2.2.5. Статистическая обработка результатов.Полученные результаты обрабатывали статистически с использованиемпрограммных пакетов BioStat Proffessional 5.8.4 и Microsoft Excel 2010.Статистическую погрешность вычисляли с учетом среднего квадратичногоотклонения качественных признаков (m).Оценку зараженности производили как в процентах, так и при помощииндекса MFIR (Minimum field infection rate), который вычислялся по формуле:(количество зараженных проб/количество комаров) х1000.59Глава 3. ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВМОЛЕКУЛЯРНОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ В МОНИТОРИНГЕ ЗАТРАНСМИССИВНЫМИ ПАРАЗИТОЗАМИ3.1.

МалярияДо настоящеговременивыявлениемалярийныхпаразитовпримикроскопическом изучении препаратов крови, окрашенных по РомановскомуГимза, в первую очередь – препарата толстая капля крови продолжает оставатьсяосновным методом паразитологической диагностики малярии и «золотымстандартом» [52, 139, 145]. Однако эффективность этого метода имеет своиограничения. В первую очередь, они могут быть связаны с исходно низкойпаразитемией, либо обусловлены относительно ограниченным количествомисследуемой крови при дефектах приготовления толстой капли, что можетпрепятствовать выявлению паразитов при их субмикроскопическом уровне [52,54]. Эти ограничения могут быть также связаны с недостаточной квалификациейперсонала.

Последнее имеет особое значение в случаях гипо- и гипердиагностикималярии. Значимость квалификации персонала неизмеримо вырастает в условияхотсутствия эндемии и появления только спорадических завозных случаевмалярии, что характерно для современных условий Российской Федерации. Всеперечисленные ограничения микроскопии обусловили необходимость поискаметодов диагностики малярии, не зависящих от квалификации микроскописта [20,21, 23, 36, 40, 52].В настоящее время при малярийной инфекции ПЦР ограниченноприменяется в диагностических целях, преимущественно в специальныхисследованиях.Материаломвэтихисследованияхобычнослужитпериферическая кровь, собранная на бумажные фильтры или цельная кровь, чтотребует дополнительного взятия крови. При этом ДНК возбудителей маляриивыделяют стандартным методом щелочного лизиса из 100 мкл крови.60НамивНИИМПиТМим.Е.И.Марциновскогобыларазработанаоригинальная методика ПЦР-диагностики малярийной инфекции, основанная навыделении ДНК из препарата крови толстая капля уже использованного примикроскопическом исследовании, т.е.

ранее окрашенного по Романовскому-Гимза[52, 132, 207]. Для уточнения порога чувствительности была проведенаспециальная серия исследований, при которых ДНК, выделенная из заведомоположительных толстых капель с паразитемией, подсчитанной на 1 мкл крови,последовательно разводилась. Данные ПЦР с разведенной ДНК позволиливычислить порог чувствительности, значения которого находились в пределах от2 до 4 паразитов в одном мкл крови [54].Возможностьиспользованияпрепаратовкровитолстаякапля,приготовленного для рутинных микроскопических исследований, для целей ПЦРдиагностики повышает и расширяет роль и значение препаратов толстая капля вэпиднадзоре за малярией и позволяет использовать эти препараты дляретроспективногоконтрольногоисследованиявцеляхисключениягиподиагностики малярии в очагах с низкой пораженностью населения [38, 41, 52,125, 214].Большая опасность восстановления на территории РФ vivax-маляриисвязана с возможностью ее завоза лицами, прибывшими с территорий,эндемичных по этой видовой форме малярии, среди которых могут бытьпотенциальные паразитоносители, в том числе с субмикроскопическим уровнемпаразитемии [37, 39, 147, 154, 159, 212].Высокая специфичность, чувствительность и автоматизированность методаПЦР позволяют успешно использовать его, как в диагностических целях,особенно как референс метод, так и при массовых обследованиях в очагахмалярии, когда необходимоежедневномикроскопировать сотнистекол.Преимущество ПЦР диагностики малярии в Референс-центрах в возможностинакопления клинического материала для постановки ПЦР 1 раз в 1-2 недели, чтозначительно сокращает трудозатраты.61В странах распространения лекарственно устойчивой тропической маляриик хлорохину (практически все страны тропического и субтропического климата,кроме стран Центральной Америки), и в случае ее завоза на территории,свободные от этой наиболее клинически и эпидемически опасной видовой формымалярии, необходимо переодически проводить мониторинг за состояниемчувствительности P.falciparum к применяемым препаратам [66, 75].

Наибольшуюэпидемическую опасность представляет лекарственная устойчивость P.falciparumстепени R1, когда после окончаниясубмикроскопическомуровне.лечения паразитемияПрименениеостается наПЦР-диагностикибудетспособствовать выявлению случаев R1 и, тем самым, снижать возможнуюлетальность и оптимизировать мониторинг [74, 75, 133, 140, 149].ПЦР-диагностика малярии имеет значительные преимущества в сравнении смикроскопическойдиагностикойнетолькопоспецифичностиичувствительности, но и по трудозатратам, особенно при массовых обследованиях.Так, микроскопия 100 препаратов крови требует для окончательного заключения,в среднем 16,5 часов, что соответствует работе трех микроскопистов в течениерабочего дня.

Характеристики

Список файлов диссертации