Диссертация (1139664), страница 14
Текст из файла (страница 14)
При этом такие тест-системыможно комбинировать с аналогичными на кишечные протозоозы, что позволитоценить уровень биологической безопасности среды обитания человека [56].Оптимизация молекулярной диагностики кишечных проозоозовНаосноветропическойбиологическойразработанныхмедициныдиагностикивНИИмедицинскойим.Е.И.Марциновскогокишечныхпаразитологииметодикпротозоозовимолекулярно-(лямблиоз,амебиаз,бластоцистоз и криптоспоридиоз) нами создана система ПЦР-диагностикипростейших кишечника для подтверждения дифференциального диагноза всложных случаях.Данная система основана на наборах праймеров к четырем основнымвозбудителям кишечных протозоозов и наборе реагентов для ПЦР (PCR-core),выпускаемом отечественной промышленностью. Структура праймеров длядиагностики простейших кишечника:G.lamblia:Прямой праймер – 5’ –GGA GAC CGA CGA GCA AAG C– 3’;Обратный праймер – 5’ – CTT GCC AAG CGC CTC AA – 3’E.histolyticaПрямой праймер – 5’ –ATG CAC GAG AGC GAA AGC AT– 3’;Обратный праймер – 5’ – GAT CTA GAA ACA ATG CTT CTC T– 3’C.parvumПрямой праймер – 5’ –CCG AGT TTG ATC CAA AAA GTT AGG AA– 3’;Обратный праймер – 5’ – CGT TAA CGG AAT TAA CCA GAC – 3’84B.hominisПрямой праймер – 5’ –GGA ATC CTC TTA GAG GGA CAC TAT ACA T–3’;Обратный праймер – 5’ – TTA CTA AAA TCC AAA GTG TTC ATC GGA C– 3’В таблице 4.8.1.
представлены режимы амплификации для обнаружениявозбудителей кишечных протозоозов.Таблица 4.8.1Режимы амплификацииСтадияG.lambliaC.parvumB.hominisНачальнаяденатурация94С – 5 мин94С – 5 мин94С – 5 мин94С – 5 минДенатурация94С – 30 сек 94С – 1 мин94С – 1 мин94С – 1 минОтжигпраймеров58С – 30 сек 45С – 2 мин60С – 1 мин63С – 1 минУдлинение72С – 30 сек 72С – 3 мин72С – 1 мин72С – 1 мин72С – 7 мин72С – 4 мин72С – 5 мин72С – 5 мин40353535КонечноеудлинениеКоличествоцикловамплификацииE.histolyticaРазмер амплифицируемого фрагмента ДНК составляет для:G.lamblia – 148 пар оснований,E.histolytica – 160 пар оснований,C.parvum – 450 пар оснований,B.hominis – 585 пар оснований.Следует отметить, что данная методика легко адаптируется для постановкиПЦР в реальном времени путем добавления в реакционную смесь реагентаSybrGreen.85Указанные условия постановки ПЦР были испытаны на 254 пробахклинического материала, взятого от пациентов с диареями неясной этиологии.
Врезультате проведенных исследований было выявлено: 102 положительныхрезультата на наличие ДНК бластоцист, 14 – криптоспоридий и 6 –дизентерийной амебы. В одном случае выявлена сочетанная инфекция, вызваннаяB.hominis и C.parvum. Все случаи протозойных заболеваний, выявленные спомощьюПЦР,быливпоследствиимикроскопическими методами.верифицированыстандартнымиГлава 5. ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ В СИСТЕМЕЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГОНАДЗОРАЗАПАРАЗИТОЗАМИ(ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ)Молекулярно-генетические исследования обычно применяют в клиническойдиагностике для выявления больных малярией в эндемичных местностях;подтверждения результатов микроскопического исследования препаратов крови;определения резистентности возбудителей к лекарственным препаратам.В системе эпидемиологического надзора эти методы применяют гораздошире:1) приэпидемиологическомобследованиипотенциальногоилиактивного очага малярии для установления происхождения случая и егоклассификации (завозной или местный);2) при поиске источников инфекции среди групп повышенного рисказаражения (сезонные рабочие, коммерсанты, иностранные студенты и др.);3) для оценки эффективности проведенных противомалярийныхмероприятий (сезонной или межсезонной химиопрофилактики);4) для мониторинга восприимчивости переносчиков к возбудителям ичувствительности к применяемым инсектицидам;5) при подтверждении достоверности отсутствия больных илипаразитоносителей в оздоровленных очагах (сертификации элиминациималярии на отдельной территории).5.1.ЭнтомологическиймониторингзапереносчикамивозбудителейдирофиляриозовПрименениепопуляционно-генетическихисследованийдляизученияпереносчиков, заражённых возбудителями дирофиляриозов, было вызванонеобходимостью энтомологического мониторинга ситуации, определения рисказаражения и оценки эффективности применявшихся мер профилактики.
В87отдельных населенных пунктах и регионах Российской Федерации, потенциальноопасных для распространения этих паразитозов.Для исследования комаров на заражённость возбудителями дирофиляриозовиспользовали полимеразную цепную реакцию, позволяющую обнаружить до 1микрофилярии в биопробах (50-100 взрослых особей комаров). В последние годыпоявились варианты ПЦР, позволяющие определить наличие в организме комараинвазионной стадии личинок некоторых филярий с помощью L-3 активного гена.За период с 2006 по 2011 год было собрано и исследовано 6891 экземпляровсамок комаров, собранных в разных районах умеренно-климатической зоныРоссии. Комары были объединены в 726 проб и проанализированы методом ПЦРна зараженность D.
repens и D. immitis [76].Изучение зараженности самок комаров в разные месяцы теплого сезона годапоказало, что зараженные D. repens комары появляются во второй декаде мая.Комары, зараженные D. immitis, были обнаружены, начиная с июня. Общаязараженность комаров (Dirofilaria spp.) одинакова в мае, июне, июле (0,86%,1,24% и 0,98% соответственно).
В августе отмечается увеличение зараженностипереносчиков (5,38%), а в 1- 2 декадах сентября – снижение до 2,46%. Данныеэнтомологического мониторинга показали, что если в 2006-2008 гг. зараженностькомаров дирофиляриями была практически одинаковой (0,44 – 0,49%), то с 2009 г.она возрастала: почти в пять раз в 2009 г., более, чем в 5 раз – в 2010 г., в 7,5 раз в 2011 г.Зараженность D. repens составляла у самок комаров р. Culex – 2,31±0,54%, ур. Aedes – 1,86±0,25%, у р. Anopheles – 3,35±1,1%. Зараженность комаров D.immitis у р.
Culex составляла 1,29±0,4%, у р. Aedes - 0,78±0,16%. У самок родаAnopheles D. immitis были обнаружены только в одной пробе с двойнымзаражением. Полученные результаты свидетельствуют о примерно идентичнойзараженности комаров разных родов. Следовательно, в отличие от малярии, гдеспецифическим переносчиком служат исключительно комары одного родаAnopheles, при дирофиляриозе передачу способны осуществлять все комары88которые встречаются на данной территории, что существенно увеличиваетвероятность сохранения гельминта – возбудителя как вида.Для оценки зараженности комаров использовали индекс MFIR (Minimumfield infection rate), вычисляемый по формуле: число проб, в которых былиобнаружены зараженные комары/общее число комаров х 1000.
В нашихисследованиях было обнаружено достоверное увеличение числа зараженныхкомаров на протяжении всех лет исследования (2006 - 2011 гг.). Пикзараженности отмечали в августе, причем максимальная зараженность былазарегистрирована в 2011 году.Из14зафиксированозараженностиобследованныхниоднойкомароврайоновМосковскогоположительнойдирофиляриями.пробы,Врегионавпятинесвидетельствующейостальныхдевятиорайонахзарегистрирована зараженность комаров, показатели которой варьировали от 1,2до 4,23%. Разработанный метод может быть использован для диагностикидирофиляриоза в крови дефинитивного хозяина (человека и плотоядных), а такжедля тестирования комаров на зараженность дирофиляриями.
На протяжении всехлет наблюдений уровень зараженности комаров различных родов отличалсянезначительно – р. Aedes - 2,64±0,29, р. Anopheles – 3,72±1,15 и р. Culex 3,59±0,7%. В то же время показатели зараженности за период исследованиязначительно возросли - c 0,44±0,18% в 2006 г. до 3,25±0,37% в 2011г.Зараженность в начале лета (май-июнь) составила в среднем за все годы 2,65%.Максимальная зараженность комаров в большинстве исследованных районовнаблюдалась в период с середины августа до середины сентября и составила всреднем за все годы 8,77%.5.2. Создание инструментов эпидемиологического надзора за тропическимиболезнями (на примере лихорадки Зика)Вирус Зика передается людям при укусах зараженных комаров рода Aedes, восновном вида Aedes aegypti, обитающих в тропических регионах.
Эти же комарыявляются переносчиками лихорадки денге, чикунгуньи и желтой лихорадки.89Лабораторная диагностика лихорадки Зика основана на анализе сывороткиилиплазмыкровинаналичиевируснойРНКилиспецифическогоиммуноглобулина (Ig) М. При этом серологические тесты обладают низкойспецифичностью по отношению к близкородственным флавивирусам (например,вируса желтой лихорадки, вируса Денге и т.д.), специфические антителаобнаруживаются в крови не ранее, чем через 4 суток после проявления симптомовболезни.
Во избежание ложноотрицательных результатов в этот период наиболеепредпочтительны тесты, основанные на детекции РНК вируса: в течение не болеечем 5-7 суток с начала проявления симптомов болезни в сыворотке или плазмекрови, и не более чем 20 суток в моче. Тесты, основанные на детекции РНКвируса,отличаютсяболеевысокойспецифичностьювотношенииблизкородственных флавивирусов по сравнению с серологическими.Так как ПЦР широко применяется для диагностики заболеваний, вызванныхфлавовирусами и является быстрым, чувствительным и специфичным методом,мы разработали набор реагентов, основанный на одностадийной ОТ-ПЦР-РВ, длядетекции РНК вируса Зика в биологическом материале.ГеномвирусаЗикапредставленположительнонаправленнойодноцепочечной РНК размером приблизительно 11 000 н.п.
Фланкирующиеучастки генома не содержат участков, кодирующих белки и известны как 5’ и 3’нетранслируемыеобласти.Транслируемыйполипротеинподвергаетсяпосттрансляционной модификации вирусной и клеточными протеазами в триструктурных белка (капсидный (C), премембранный (prM) или мембранный (М) иоболочечный (Е)) и семь неструктурных (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b иNS5).Для выбора гена-мишени был проведен сравнительный анализ геномов какблизкородственных вирусов (вирусов Денге типов 1,2,3,4; Японского энцефалита;лихорадки Западного Нила; Желтой лихорадки; Спондвени), так и известныхпоследовательностей вируса Зика. Исходя из результатов анализа в качестве генамишени был выбранрегионNS2B-NS3, которыйотвечал требованиям90специфичности по отношению к близкородственным вирусам, так и гомогенностивнутри штаммов вируса Зика.Подбор праймеров и зондов осуществлялся исходя из следующихкритериев:1) Специфичность. Минимальное количество мисматчей с неспецифическоймишенью – 2 нуклеотида в пределах первых пяти нуклеотидов с 3'-конца.2) Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делецийили инсерций.3) Температура отжига праймеров не должна быть ниже температурыстадии отжига в программе амплификации более, чем на 5 градусов цельсия.4) Размер ампликона не должен превышать 300 н.п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
