Диссертация (1139664), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Е.И. Марциновского ПЦР-диагностика [52]. Как ужеуказывалось ПЦР-диагностика малярии имеет значительные преимущества всравнении с микроскопической диагностикой не только по специфичности ичувствительности, но и по трудозатратам, особенно при массовых обследованиях.Так, микроскопия 100 препаратов крови требует для окончательного заключения,в среднем 16,5 часов, что соответствует работе трех микроскопистов в течение102рабочего дня. Использование ПЦР позволяет при наличии одного термоциклеравыполнить эту работу одному человеку за один рабочий день.При финансовой поддержке Глобального Фонда по борьбе со СПИД,туберкулёзом и малярией были приобретены экспресс-тесты CareStartbMalariaHPR2/PLDH (P.falciparum/P.vivax) COMBOGO161 AccessBio. Исследования былипроведены в 2012 г.
в населенных пунктах Кумсангирского, Кабадиянского,Хатлонскоговилоятов и Вахдатского района Республиканского подчинения [54].Молекулярная диагностика образцов крови из Республики Таджикистанпроводилась нами в НИИМПиТМ им. Е.И. Марциновского Первого МГМУим.И.М.Сеченова. Всего было исследовано 750 препаратов крови, выборочновзятых у жителей оздоровленных очагов малярии с целью проверкидостоверности отсутствия местной передачи.
Все исследования проводились постандартным методикам, изложенным в главах 2 и 3 настоящей диссертации.Для определения качества выделения ДНК проводили ПЦР с праймерами,гомологичными участку 15978-15997 и 16545-16526 мтДНК человека. Дляидентификации возбудителей малярии рода Plasmodium проводили ПЦР двумяпраймерами, описанными в главах 2 и 3 настоящей диссертации и специфичнымик гену 18S РНК всех представителей этого рода.
Для уточнения результатовэксперимента в ряде случаев проводилась амплификация образцов ДНК спраймерамиVIV1 5’-CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC-3’ и VIV25’-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA-3’, специфичными к гену 18SРНК P. vivax, праймерами VDTO F 5’-ATG GAG GAC CTT TCA GAT GTA TTTGAC ATT-3’ и VDFO R 5’-CTT GCT GTA AAC CAA AAA GTC CA-3’,специфичными к фрагменту гена дегидрофолатдегидрогеназы.ВкачествеположительногоконтроляприменялиДНК,котораяиспользуется в указанном качестве в работе Референс-центра по трансмиссивнымпаразитарным болезням на базе НИИ медицинской паразитологии и тропическоймедицины им.
Е.И.Марциновского Первого МГМУ им. И.М.Сеченова.Всегобыло выделено и использовано 10 образцов положительного контроля ДНК.Результаты визуализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.103Иммунологические исследования были проведены с использованием экспресстестовCareStartbMalariaHPR2/PLDH(P.falciparum/P.vivax)COMBOGO161AccessBio в населенных пунктах Кумсангирского, Кабадиянского, ДангаринскогорайоновХатлонскоговилоятаиВахдатскогорайонаРеспубликанскогоподчинения.В населенных пунктах Кумсангирского района было обследовано 2000 лицразного возраста с помощью тестов и параллельно с микроскопией толстой капликрови [54].
В ходе проведенного нами исследования с помощью метода экспресстестов случаев обнаружения возбудителей малярии не было. Все препаратытолстой капли крови были доставлены в паразитологическую лабораториюЦентра по борьбе с тропическими болезнями Хатлонского вилоята, гдепроводилось микроскопическое исследование. 10% отрицательных препаратовповторно подвергали микроскопии в Референс-лаборатории Республиканскогоцентра по борьбе с тропическими болезнями (РЦБТБ). Все результаты былиотрицательными,т.е.идентичнырезультатамполевыхисследованийсприменением экспресс-тестов [54].В населённых пунктах Кабадиянского района было обследовано 2000человек. Из общего числа обследованных лиц с помощью экспресс-метода только1 дал положительный результат. Контрольная микроскопия препаратов крови впаразитологической лаборатории РЦБТБ не подтвердила наличие паразитов впрепаратах крови.В 2014 году было исследовано 750 образцов крови жителей оздоровленныхочагов в районах Таджикистана с применением молекулярной диагностики –полимеразной цепной реакции (ПЦР) [155].
Для контроля выделения ДНК былапроведена ПЦР с праймерами, специфичными к участку митохондриальногогенома человека. Положительный фрагмент специфического размера длинойоколо 500 п.н. был получен во всех изученных образцах, что доказывает хорошеекачество выделенных препаратов ДНК. Продукты амплификации длиной около1000 п.н., характерные для всех малярийных паразитов р. Plasmodium, висследованных образцах получены не были.
В ряде случаев в образцах104проводился дополнительный контрольный анализ с праймерами VIV1 и VIV 2,праймерами VDTOF и VDFOR. На электрофореграмме видно, что положительныйконтроль при амплификации с праймерами VIV1 и VIV2 имеет специфическийфрагмент 120 п.н.
Ни в одном из проведенных экспериментов не былообнаружено четкого положительного признака, подтверждающего наличиевозбудителя малярии. 750 образцов крови жителей оздоровленных очагов врайонах Таджикистана были исследованы с применением молекулярнойдиагностики – ПЦР и показали отсутствие малярийных паразитов. Достоверностьотсутствия источников инфекции и местной передачи малярии через комаровбыла доказана при применении комплекса трёх методов: микроскопической,иммунологической и молекулярной диагностики.Полученные нами результаты являются достаточными для подтвержденияотсутствия местной передачи возбудителя трехдневной малярии на территорииРеспублики Таджикистан в соответствии с требованиями ВОЗ по сертификацииэлиминации малярии.5.5.
Скрининг населения с применением ДНК-диагностики в очагахвисцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской областиРеспублики УзбекистанПервые случаи заболевания висцеральным лейшманиозом (ВЛ) в Папскомрайоне Наманганской области Республики Узбекистан были зарегистрированыеще в 1987 г., ранее в этих населенных пунктах случаи заболевания никогда невыявляли [26]. С 1987 по 2000 гг.
число случаев колебалось от 0 до 5 случаевзаболевания в год (всего 20 случаев). С 2001 г. наблюдается ежегодный ростслучаев заболевания (всего 75 случаев). Кроме того, за последние 9 лет более чемв два раза выросло число очагов, где был зарегистрирован ВЛ (таблица 5.5.1) [26,35].105Таблица 5.5.1Распределение больных висцеральным лейшманиозом по очагам вПапском районе Наманганской области (1987-2009 гг.)Число больныхВсегоНаименованиенаселенного1987-20002001-2009ЧислоПроцентпунктагг.гг.больных(%)Чодак8354345,3Чоркесар2141616,8Олтинкан761313,7Гулистан3144,2Хонабад444,2Янгиобад101010,5Маданият222,1Янгиер222,1Голиб111,1Всего207595100Наибольшее число новых случаев было отмечено в кишлаках Чодак – 43(45,3%), Чоркесар – 16 (16,8%), Олтинкан – 13 (13,7%) и Янгиобад – 10 (10,5%).В период наших исследований в Папском районе Наманганской области в2007-2009 гг.
было зарегистрировано 30 больных. Анализ выявленных случаев за9 месяцев 2009 г. показал, что из 22 больных с подтвержденным диагнозом ВЛ,выявленных в Папском районе Наманганской области, в населенном пунктеЧодак было зарегистрировано 4 больных, Чоркесар - 7, Янгиобад - 7, Хонабад - 2,Олтинкан - 1 и в Янгиер - 1. После санитарно-просветительной работы срединаселения за медицинской помощью заболевшие жители стали обращаться вболее ранние сроки, в основном, через 2-3 дня от начала клинических проявленийзаболевания [35].
Такого раннего обращения медицинские работники ранее неотмечали. Основными жалобами при обращении были лихорадка и слабость.Однако только в двух случаях диагноз ВЛ был поставлен как первичный. Какправило, первоначальными диагнозами были ОРВИ или анемия, что говорит онедостаточной клинической настороженности и знаниях врачей в отношении ВЛ.Среди обследованных методом ПЦР детей были выделены 4 группы.106Первую группу составили 4 ребенка с классическими симптомами ВЛ:лихорадкой и гепатоспленомегалией. Возраст двух больных девочек - 8 лет,одного мальчика – 1 год, другого мальчика – 2 года. У всех детей диагноз ВЛ былподтвержденобнаружениемлейшманийвмазкахкостногомозгаиположительной ПЦР.
У 3-х из 4-х больных ВЛ посев материала костного мозга напитательную среду дал положительный результат. У 1 ребенка для исследованияметодом ПЦР были взяты 2 образца: пунктат костного мозга и кровь из пальца. Вобразце крови ДНК лейшмании не была обнаружена, а образец костного мозгадал положительный результат [24, 25, 26, 35].Таким образом, было установлено, что при использовании ПЦР длядиагностики ВЛ следует использовать не кровь, а пунктат костного мозга. Кровьследует исследовать только в том случае, когда получение препарата костогомозга невозможно. В таком случае надо стремиться исследовать не один, анесколько препаратов крови.
Использование нескольких препаратов кровиповышает вероятность обнаружения лейшманий. Однако чувствительность ПЦРдиагностики ВЛ по крови ниже, чем по костному мозгу. Вероятность постановкиПЦР-диагноза ВЛ существует только при высокой паразитемии [24, 25, 26, 35].Вторая группа.
Были обследованы 13 детей, переболевших ВЛ в прошлыегоды. Во время болезни все дети прошли курс лечения глюкантимом. На моментобследования дети выглядели здоровыми. Однако у 6 (46,2%) реакция ПЦР былаположительная. Положительной была реакция не только у 3-х из 8 детей,выздоровевших менее года назад, но даже у детей, переболевших 2, 7 и даже 10лет назад. Правда, в соответствующих группах детей было выявлено только поодному ПЦР-положительному переболевшему. Анализ возраста возникновениязаболевания показал, что один ребенок перенес ВЛ в возрасте до года, 10 (76,9%)детей - в возрасте 1-3 года и по 1 ребенку в возрасте 7 и 12 лет [24, 25, 26, 35].Среди переболевших были выявлены дети из одной семьи (2 сестры),проживающие в кишлаке Олтикан, которые перенесли заболевание в разные годы- 2000 и 2007 гг. соответственно.
Старшая сестра заболела в возрасте 3 лет, амладшая – в возрасте двух лет. Временной интервал между этими случаями ВЛ107составил семь лет. На момент исследования обе переболевшие оставались ПЦРположительными. Кроме этих двух сестер в этой семье было еще семь детей ввозрасте от 2 до 11 лет, из которых было обследовано еще пять человек. Всеобследованные дети оказались ПЦР-положительными, хотя в анамнезе у нихотсутствовал клинически выраженный ВЛ [24, 25, 26, 35].По данным некоторых авторов лейшмании после лечения исчезают несразу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
