Диссертация (1139664), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Ак-Турпок и с. Бургонди Баткенскооговилоята). Всего было собрано128 образцов крови от 60 больных с клиническимипризнаками малярии, а также у 157 лиц, контактировавших с больными. Возрастбольных был от 1 года до 80 лет, доля лиц до 15 лет составила 25%. Кровь быласобрана в стерильные контейнеры с ЭДТА и сохранялась при t° = 4°С. Всего былособрано 285 образцов. ДНК выделяли стандартным методом щелочного лизиса из100 мкл крови.96Всего было исследовано 149 образцов крови больных малярией.
Врезультате реакции амплификации получен характерный продукт длиной около1600 п.н. С эпидемиологической точки зрения важно, чтоспецифическаяамплификация в образцах крови членов семей, заболевших не наблюдалась. Этозначит, что внутридомовая и внутрисемейная передача возбудителя малярии наобследованных территориях отсутствовала.В результате видовой идентификации возбудителей характерный продуктдлиной около 310 п.н. был получен только с праймерами rVIV1 и rVIV2,специфичными к 18S ДНК P. vivax.В гене msp-1 была проанализирована структура шестого вариабельногоблока.
В результате амплификации образцов крови, содержащих ДНК P. vivax, спраймерами, специфичными к участку гена белка мерозоита, был полученспецифический продукт амплификации размером от 615 п.н. до 700 п.н. Дляопределенияпоследовательностинуклеотидовизучаемогоучасткабылопроведено секвенирование полученного ПЦР-продукта для образцов из городовБишкек, Ташкомур и Ошского вилоята. Для сравнения были проанализированыобразцы крови больных из очага трёхдневной малярии Хатлонского вилоятасоседнего Таджикистана.В результате секвенирования было показано, что размер исследованныхпоследовательностей варьировал от 699 п.н. до 615 п.н. за счет продолжительныхделеций-инсерцийвобластиполи-Qмикросателлитныетринуклеотидныеповторов.повторы,Q-повторыкодирующие–этоаминокислотуглицин.
В большинстве случаев микросателлит образован нуклеотидами САА, нозамена по третьему положению кодона приводит к появлению микросателлитаСАG. За счет вырожденности генетического кода подобная замена не приводит кзамене аминокислоты. Длина Q-повторов у изученных изолятов P. vivaxколеблется от 2 до 25 аминокислот (изолят Td21). Q-повторы из 25 аминокислот самые длинные из обнаруженных ранее. Длина Q-повторов у изолятов,зарегистрированных в международной базе данных GeneBank, не превышает 21аминокислотного остатка (рисунок 5.3.1.).97Рисунок 5.3.1.
Выравнивание участка аминокислотных последовательностейбелка MSP в области Q-повторов. Образцы из Кыргызстана: B1, B30, P11,Р16 - образцы ДНК больных малярией из г. Ташкумыр, А11, А4 – образцыДНК пациентов из города Бишкек, В-79, В-90 – образцы ДНК пациентов изБаткенскоговилоята. Td – образцы ДНК пациентов из Хатлонской вилоятаТаджикистана.Изучение молекулярно-генетической структуры популяций возбудителей ифилогенетическийанализвыявилитрикластеравозбудителей.Первыйсформирован возбудителями, обнаруженными в городах Ташкумыр и Бишкек,второй - возбудителями из Баткенского вилоята, третий – возбудителями изБаткенского вилоята Республики Кыргызстана и возбудителями из Хатлонскоговилоята Таджикистана [54, 108].
Различия первичной структуры изучаемогоучастка гена msp-1 P. vivax возбудителей из разных кластеров при попарномсравнении могут достигать 29%. Наименьший уровень гетерогенности популяцийбыл выявлен в недавно образовавшемся очаге малярии на западной границеРеспублики Kыргызстана - в городе Ташкомур, а также в популяции городаБишкек. На основании наших данных можно констатировать, что для популяции98жителей города Ташкомур характерна исключительно высокая (99%) гомологияизученных последовательностей.
Выявленный нами факт с большой долейвероятности свидетельствует об относительно недавнем формировании данногогородского очага малярии. Более того, указанный очаг сформировался врезультате однократного заноса возбудителя трехдневной малярии и дальнейшегораспространения этого клона возбудителя через популяцию местных комаров –переносчиков.KyrgBishA11KyrgJalB3098 KyrgJalP11KyrgJalP16100KyrgJalB1KyrgBishA4Td21KyrgBatB7999KyrgBatB90Td14Td229974 Td260.150.100.050.00Рисунок 5.3.2. Дендрограмма сходства аминокислотных последовательностейучастка белка MSPI. Образцы из Кыргызстана: KyrgJalB1, PKyrgJal11,KyrgJalР16 - образцы больных из г. Ташкомур, KyrgBisА11, KyrgBisА4 –образцы больных из города Бишкек, KyrgBatВ-79, KyrgBatВ-90 – образцыбольных из Баткенскоговилоята. Td – образцы крови больных изХатлонского вилоята ТаджикистанаДругаяРеспубликиииэпидемическаяКыргызстан,ситуациясложиласьгдевыявленбылвБаткенскомвилоятепромежуточныйуровеньгенетической гетерогенности возбудителей трехдневной малярии (рисунок 5.3.2):образцы KyrgBatВ79 и KyrgBatВ90.
На севере указанная область граничит с99Республикой Узбекистан, на юге - с Республикой Таджикистан. Гомологияпоследовательностей изолятов из Баткенского вилоята составляет 81%.Статистический и филогенетический анализ позволяют утверждать, что данныйочаг был сформирован в результате заноса возбудителей, по крайней мере, издвух источников, поскольку возбудители из Баткенского вилоята попадают в двакластера. Изоляты P.
vivax в первом кластере филогенетически близки кТаджикским изолятам, уровень их гомологии составляет в некоторых случаях99%. Однако, в некоторых населенных пунктах Баткенской области выявляютсявозбудители, филогенетически далекие от возбудителей Таджикистана (образецKyrgBat79). Более высокий уровень полиморфизма маркерной области геномавозбудителей из Баткенского вилоята коррелирует с данными о более высоком,по сравнению с г. Ташкомур, уровне заболеваемости трехдневной малярией вэтом регионе. Популяция P. vivax Хатлонского вилоята является наиболеегетерогенной, в ней обнаруживаются возбудители, филогенетически близкие квозбудителям из стран Юго-Восточной Азии.В результате было установлено, что популяции возбудителей Кыргызстанасостоят из различных изолятов P.vivax, что не может обеспечить селекциювозбудителей в очагах малярии.
Низкий уровень генетической изменчивости даётоснование полагать, что паразитарные системы трёхдневной малярии в условияхэпизодических заносов возбудителей не являются адаптированными, что взначительной степени определяет невозможность укоренения малярии.Таким образом, удалось подтвердить чрезвычайную важность результатов,полученныхвпопуляционныхобследованияхспомощьюмолекулярно-генетических методов, для эпидемиологического анализа и получения детальнойхарактеристики истории формирования новых очагов малярии. Без использованияметодологии ПЦР-исследований в эпидемиологическом надзоре за маляриейполучениенеобходимыхдостоверныхэпидемиологического анализа невозможно.данныхретроспективного1005.4.
Проверка достоверности отсутствия больных малярией в оздоровленныхочагах комплексом лабораторных методов диагностикиНагляднымпримеромэффективногоиспользованиякомплексалабораторных методов диагностики (микроскопической, иммунологической имолекулярной) в эпидемиологическом надзоре за малярией являются нашисовместные исследования с Республиканским Центром тропических болезнейРеспублики Таджикистан в последние годы [54].Основным фактором распространения малярии в Республике Таджикистанявляетсязавозсопредельнойинфекциитерриторииизалёт заражённыхИсламскогомалярийныхГосударствакомаров сАфганистан(ИГА).Тропическая малярия в Республике Таджикистан была элиминирована в 2008 г.
Втекущем 2016 г. предстоит изучение и подтверждение достижения элиминациятрёхдневной малярии (Plasmodium vivax) на указанной территории. Значительноеулучшение маляриологической ситуации в Республике Таджикистан такжеподтверждает резкое снижение числа завозных случаев трёхдневной малярии вРоссию: только 2 – в 2011 г., 1 - в 2012 г., 1- в 2015 г., что было выявлено врезультате эпидемиологического мониторинга, осуществляемого в РоссийскойФедерации.В соответствии с требованиями ВОЗ окончательным подтверждениемдиагноза малярии является обнаружение возбудителей при микроскопическомисследовании препаратов крови (толстая капля и тонкий мазок), которое принятоназывать «золотым стандартом». В качестве дополнительных методов применилииммунологические для выявления специфических антител в сыворотке кровибольного (реакция иммуно-флуоресцирующих антител или экспресс-тесты) имолекулярные – для выявления ДНК паразита (полимеразная цепная реакция)[54].
Поскольку микроскопия препарата крови имеет ограничения, связанные сисходно низкой паразитемией при трёхдневной малярии после длительнойинкубации, с недостаточной квалификацией персонала (дефекты приготовления101препарата крови), были применены методы паразитологической диагностикималярии, не зависящие от квалификации лаборанта-микроскописта.Для лабораторного подтверждения случаев малярии были использованыэкспресс-тесты,основанныенавзаимодействииантигеновмалярийногоплазмодия с моноклональными антителами, нанесенными на тест. ВсемирнаяОрганизация Здравоохранения (ВОЗ) рекомендует применять эти тесты на любыхтерриториях, где высокое качество микроскопии обеспечить невозможно.
Кдостоинствам экспресс-метода относят быстрое получение ответа, относительновысокую специфичность, простое их использование, транспортировка и хранение,возможностьпроведенияисследованиябезспециальнойподготовкиилабораторного оборудования. Это обусловлено необходимостью диагностики вопределённых условиях (полевые, перебои подачи электроэнергии, отсутствиелаборатории или квалифицированных лаборантов), когда использование экспресстестов является методом выбора для быстрого определения возбудителей маляриив крови человека.В периоде элиминации малярии в Республике Таджикистан, когда числослучаевиочаговпопуляционныхисточниковзначительноисследованийинфекциивуменьшилось,дляпроверкинеактивныхочагах,появиласьнеобходимостьдостоверностиучитываяотсутствиявозможностьвосстановления и распространения малярии в южных районах, пограничных сИГА [54].Крометого,былаапробированавполевыхусловияхреальногоэпидемиологического популяционного обследования разработаная нами вНИИМПиТМ им.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
