Диссертация (1139664), страница 13
Текст из файла (страница 13)
ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВМОЛЕКУЛЯРНОЙ ПАРАЗИТОЛОГИИ В МОНИТОРИНГЕ ЗАНЕТРАНСМИССИВНЫМИ ПАРАЗИТОЗАМИ4.1. КриптоспоридиозПрименениемолекулярно-генетическихметодовдляиндикацииCryptosporidium parvum может иметь целью как рутинную диагностикукриптоспоридиоза у пациентов, так и, что более важно с точки зренияосуществлениясанитарно-эпидемиологическогонадзораиобеспечениябиологической безопасности страны, обнаружение этого патогена в питьевой водеи водных объектах среды обитания человека [58, 138, 188, 198, 211, 213]. Намибылаотработанаипредложенаметодикаобнаружениявозбудителякриптоспоридиоза, которая может успешно применяться для выполнения этихцелей.
Для этого по литературным данным были подобраны оптимальныепраймеры и оптимизированы режимы амплификации для этих праймеров.Выбранные праймеры проверялись на гомологичность и отсутствиеперекрестных реакций в базе данных генетической информации Genbank спомощью компьютерной программы Blast.В результате были выбраны следующие праймеры для детекции паразитовCryptosporidium parvum [148, 164, 189].Прямой праймер - CCGAGTTTGATCCAAAAAGTTAGGAA;Обратный праймер – CGTTAACGGAATTAACCAGAC.Экспериментальнымпутембылоустановлено,чтооптимальнойтемпературой отжига праймеров является 45º С. Для увеличения количествапродукта ПЦР количество циклов амплификации увеличили до 35. В результатепроведенной оптимизации температуры отжига праймеров и времени элонгациибыл выбран следующий режим амплификации (таблица 4.1.1.).76Таблица 4.1.1Оптимизированные режимы амплификацииСтадияРежимНачальная денатурация95С – 5 минДенатурация95С – 1 минОтжиг праймеров45С – 2 минУдлинение72С – 3 минКонечное удлинение72С – 4 минКоличество циклов амплификации35Визуализация продукта ПЦР проводилась в 1,5 % агарозном геле,окрашенном бромистым этидием.При оценке результата ПЦР ожидаемый размер продукта (относительномаркера) для С.
parvum - 400 - 451 в. р.4.2. ЛямблиозПраймерыдлядиагностикилямблиозаподбиралисьнаоснованиилитературных данных о нуклеотидной последовательности Giardia lamblia(Lamblia intestinalis) [115, 116, 163, 189, 203] и собственной практики.Выбранные праймеры проверялись на гомологичность и отсутствиеперекрестных реакций в базе данных генетической информации Genbank спомощью компьютерной программы Blast.В результате были выбраны следующие праймеры для детекции паразитовGiardia lamblia.Прямой праймер – 5’ –GGAGACCGACGAGCAAAGC– 3’;Обратный праймер – 5’ – CTTGCCAAGCGCCTCAA – 3’.Экспериментальнымпутембылоустановлено,чтооптимальнойтемпературой отжига праймеров является 58º С. Для увеличения количествапродукта ПЦР количество циклов амплификации увеличили до 40.77В результате проведенной оптимизации температуры отжига праймеров ивремени элонгации был выбран следующий режим амплификации (таблица4.2.1.).Таблица 4.2.1Оптимизированные режимы амплификацииСтадияРежимНачальная денатурация94С – 5 минДенатурация94С – 30 сек.Отжиг праймеров58С – 30 сек.Удлинение72С – 30 сек.Конечное удлинение72С – 7 минКоличество циклов40амплификацииВизуализация продукта ПЦР проводилась в 1,5 % агарозном геле,окрашенном бромистым этидием.При оценке результата ПЦР ожидаемый размер продукта (относительномаркера) для Giardia lamblia –148 пар оснований (рисунок 4.2.1.).78123Рисуноквозбудителей44.2.1.56 7 89 10 11 12 13 14Электрофореграммалямблиоза,полученныхспродуктовамплификациииспользованиемотобранныхпраймеров (линии 1 – 11 положительные образцы от больных лямблиозом,линия 12- отрицательный контроль, линия 13 – положительный контроль,линия 14 – стандартный маркер)4.3.
АмебиазДифференциацияпатогеннойинвазивнойEntamoebahistolyticaоткомменсалов E.dispar или E.moshkovskii невозможна на основе морфологическихмикроскопических исследований [124, 142, 215]. Для осуществления подобнойдифференциальной диагностики критически важной для постановки диагноза иопределения тактики лечения необходимо использовать молекулярные методы, вчастности ПЦР.Кишечныйамебиазнеобходимодифференцироватьсдиарейнымиболезнями, протекающими с признаками колита и с кровью в испражнениях.79Появление крови в испражнениях обращает внимание больного, а такжемедицинского персонала.
Этот признак может наблюдаться при болезнях,вызванныхпростейшими(балантидиаз),кампилобактериоз,сальмонеллез,анкилостомоз),такжеаэшерихиоз),неинфекционнымибактериями(дизентерия,гельминтами(шистосомоз,болезнями(неспецифическийязвенный колит, новообразование кишечника, болезнь Крона, дивертикулярнаяболезнь, пеллагра и др.).Одним из методов диагностики амебиаза является полимеразная цепнаяреакция(ПЦР).Еёвысокаячувствительностьпозволяетобнаружитьвисследуемом материале единичные клетки и даже их фрагменты ДНК. Методисключает перекрёстные реакции и специфичность достигает 100%. Также косновным достоинствам метода ПЦР относятся: простота и удобство проведенияанализа; сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа;умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость [103, 104, 105].Праймерыдлядиагностикиамебиазаподбиралисьнаоснованиилитературных данных о нуклеотидной последовательности Entamoeba histolytica[182, 199, 208] и собственной практики.Выбранныепраймерыпроверялинагомологичностьиотсутствиеперекрестных реакций в базе данных генетической информации Genbank спомощью компьютерной программы Blast.В результате были выбраны следующие праймеры для детекции паразитовEntamoeba histolytica.Прямой праймер – 5’ –ATG CAC GAG AGC GAA AGC AT – 3’;Обратный праймер – 5’ – GAT CTA GAA ACA ATG CTT CTC T – 3’.Экспериментальнымпутембылоустановлено,чтооптимальнойтемпературой отжига праймеров является 63º С.
Для увеличения количествапродукта ПЦР количество циклов амплификации увеличили до 35. В результатепроведенной оптимизации температуры отжига праймеров и времени элонгациибыл выбран следующий режим амплификации (Таблица 4.3.1.).80Таблица 4.3.1Оптимизированные режимы амплификацииСтадияРежимНачальная денатурация94С – 5 минДенатурация94С – 1 минОтжиг праймеров63С – 1 минУдлинение72С – 1 минКонечное удлинение72С – 5 минКоличество циклов35амплификацииВизуализация продукта ПЦР проводилась в 1,5 % агарозном геле,окрашенном бромистым этидием.При оценке результата ПЦР ожидаемый размер продукта (относительномаркера) для Entamoeba histolytica - 166 пар оснований4.4. ТоксоплазмозВ настоящее время в России выпускается ряд тест-систем на основе ПЦРдля диагностики токсоплазмоза у больных, в том числе и для ПЦР в реальномвремени.
В качестве материала для исследования предлагается использоватькровь, амниотическую жидкость, слезную жидкость [15, 193, 210]. Однако сучетом сложного жизненного цикла Toxoplasma gondii, вероятность обнаруженияпаразита в крови крайне мала, поскольку в момент активных клиническихпроявлений паразит отсутствует в кровеносном русле [120, 153, 172, 179, 185].Нами было поставлено более 150 реакций ПЦР (из них 48 ПЦР в реальномвремени). Положительных результатов выявлено не было.Значительно информативней постановка реакции с использованием вкачестве источника ДНК слезной жидкости или околоплодных вод, поскольку вэтом биологическом материале может содержаться возбудитель, а процедуравыделения ДНК в этих случаях значительно упрощена.814.5.
ТрихомониазМолекулярная диагностика трихомониаза широко применяется в настоящеевремя в практике клинико-диагностических лабораторий всех уровней [49].Разработаны тест системы как для классической ПЦР, так и для ПЦР в реальномвремени [121, 157, 196]. Преимущества ПЦР при диагностике трихомониазаочевидны, поскольку методика выделения ДНК из отделяемого влагалищазначительно проще, чем при остальных паразитозах, что сокращает времяпостановки реакции, уменьшает ее стоимость и трудозатраты, а такжеминимизирует ложноотрицательные результаты.4.6. БластоцистозДо недавнего времени Blastocystis hominis не рассматривались какэтиологический фактор патологических состояний человека. Более того,некоторые исследователи вообще сомневались в патогенных потенциях B.hominisисчиталибластоцитознезаболеванием,абезвреднымтранзиторнымносительством непатогенных микроорганизмов [32].
Заболевания, вызванныеB.hominis, обычно рассматривали как экзотические протозойные инфекции,связанные с путешествиями в тропические и субтропические страны.В то же время, и в странах с умеренным климатом поражения кишечника,обусловленные B.hominis, не так уж редки. В настоящее время эти паразитыобнаружены не только в Африке и Азии, но и в Европе, Северной и ЮжнойАмерике, Австралии, то есть расселение В. hominis можно считать всесветным[32]. В последние годы накопилось достаточное количество эпидемиологическихи клинических материалов, а также лабораторных данных, подтверждающих какпотенциальную, так и реальную этиологическую роль B.hominis в патологиичеловека, развивающейся на фоне снижения резистентности макроорганизма [95,96, 104, 191].
Основными клиническими проявлениями бластоцистоза являютсядиарея и абдоминальные боли. Заболевание развивается по типу энтерита,энтероколитаиликолита.Многочисленныесообщенияубедительносвидетельствуют об этиологическом и патогенетическом значении бластоцист в82развитии диарейного синдрома. Так, например, проведенное в 1986 году вЮгославии целенаправленное паразитологическое исследование подтвердиловысокую частоту обнаружения бластоцист при хронических заболеваниях, когдадиарейный синдром имел рецидивирующее течение и продолжался не менееодного месяца [32].Особенно актуальной проблема бластоцистоза становится в связи с резкимувеличением числа ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом, так как уиммунокомпрометированных людей B.hominis легко вызывают хроническиепоражения пищеварительной системы.Диагнозбластоцистозаставитсянаоснованиимикроскопическогоисследования методом нативного мазка.
Однако диагностика бластоцистозазатруднена обилием различных морфологических форм бластоцист.В НИИ МПиТМ им.Е.И.Марциновского впервые в России была внедренаПЦР-диагностика бластоцистоза, которая, наряду с методиками ПЦР-диагностикикриптоспоридиоза, лямблиоза и амебиаза, должна помочь в дифференциальнойдиагностике кишечных протозоозов.4.7. БиогельминтозыВ диагностике биогельминтозов у человека молекулярно-биологическиеметоды имеет достаточно ограниченное применение [173]. Это связано сособенностями жизненного цикла возбудителей.
ПЦР-диагностика тканевыхгельминтозов, таких как трихинеллез, цистицеркоз, фасциолез, парагонимоз и пр.,невозможна из-за отсутствия паразитов или их частей в выделениях человека. Придиагностике этих заболеваний предпочтение следует отдавать иммунологическимметодам (ИФА, РИФ). Ограниченные возможности для ПЦР-диагностикиостаются в отношении ленточных гельминтов, но и в этом случае молекулярныеметоды практически не применяются, т.к. микроскопическое исследование нетребует длительной пробоподготовки и имеет значительные преимущества как почувствительности, так и по трудозатратам.834.8.
ГеогельминтозыОсновным направлением применения методов молекулярной паразитологиив отношении геогельминтозов является санитарная паразитология [46, 123, 161]. Внастоящее время разрабатываются различные типы тест-систем для поискавозбудителейгеогельминтозов в среде обитания человека:почве, водеповерхностных водоемов, а также питьевой воде.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
