Диссертация (1139664), страница 15
Текст из файла (страница 15)
(максимальнодопустимый размер ампликона для обратной транскриптазы).5) У праймеров должны отсутствовать любые димеры со свободнойэнергией образования менее -4 и 3’-димеры со свободной энергией образованияменее -2.6) Олигонуклеотидный зонд типа Taqman.7) Температура отжига зонда должна составлять от 60 до 80 градусовцельсия.8) Длина олигонуклеотидного зонда должна быть максимально короткой.9) Зонд не должен содержать на 5’-конце нуклеотид G (гуанин).Выбор методики пробоподготовки осуществлялся исходя из следующихкритериев:1) Используемые вещества не должны быть высокотоксичными.2) Препарат выделенной РНК должен обладать чистотой, приемлемой дляпроведения обратной транскрипции.3) Метод не должен быть трудозатратным, общее время пробоподготовки недолжно превышать 2 часа.Для определения диагностической чувствительности и специфичности былиприготовлены 100 образцов мочи, 100 образцов сыворотки крови и 100 образцовплазмы крови.
В 50 образцов каждого типа была внесена РНК вируса Зика до91конечной концентрации, варьирующейся в диапазоне от 106 до 3*102 копий/млобразца (таблица 5.2.1.). В целях предотвращения деградации нативной РНК внативном биоматериале раствор РНК добавлялся непосредственно на стадиилизиса. Наличие или отсутствие аналита в образцах было подтверждено спомощью наборов сравнения QIAamp® Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Германия) и«RealStar Zika virus RT-PCR Kit 1.0» (Altona Diagnostics Gmb, Германия). Образцыбылипараллельнопроанализированыспомощьюнаборареагентов«ФЛАВИСКРИН-ZIKV».Диагностическая чувствительность определялась как доля, выраженная в %,истинно положительных результатов ко всем получившимся положительными,включая ложноположительные и составила 100%. Для расчета нижней границыинтервала,вкоторомнаходится«истинное»значениедиагностическойчувствительности с доверительной вероятностью С = 90% использоваласьследующая формула:(1-C/100)1/n *100%, где:n – общее число исследуемых проб с истинно положительнымирезультатами анализа, подтвержденные с помощью набора сравнения,C – доверительная вероятность, в данном исследовании принята равной90%.Нижняя граница интервала, в котором находится «истинное» значениедиагностической чувствительности с доверительной вероятностью 90% составила95,5%.Таблица 5.2.1Характеристика клинического материала для определения диагностическойчувствительностиЧисло образцов сРезультаты испытуемогоДиагностическаяКлиническийистиннонаборачувствительностьматериалположительными Положительные ОтрицательныерезультатамиСывороткакрови5050095,5-100%ПлазмакровиМоча5050095,5-100%5050095,5-100%92Диагностическая специфичность определялась как доля, выраженная в %,истинно отрицательных ко всем получившимся отрицательными и составила100%.
Для расчета нижней границы интервала, в котором находится «истинное»значение диагностической специфичности с доверительной вероятностью С =90% использовалась следующая формула:(1-C/100)1/n *100%, где:n – общее число исследуемых проб с истинно положительными результатамианализа, подтвержденные с помощью набора сравнения,C – доверительная вероятность, в данном исследовании принята равной 90%.Нижняя граница интервала, в котором находится «истинное» значениедиагностической чувствительности с доверительной вероятностью 90% составила95,5%.Таблица 5.2.2Характеристика клинического материала для определения диагностическойспецифичностиКлинически Число образцовсистиннойотрицательнымиматериалрезультатамиРезультатынабораиспытуемого ДиагностическаяспецифичностьПоложительны ОтрицательныееСыворотка50крови50095,5-100%Плазмакрови5050095,5-100%Моча5050095,5-100%Для подтверждения аналитической чувствительности на этапе выходногоконтроля наборов реагентов из образцаplZIKV-tr был приготовлен ипроанализирован КОЧ-ZIKV с концентрацией 3*102 копий/мл в десятиповторностях.
Значение Ct всех десяти повторностей составило <45, чтопозволяет использовать данный образец для подтверждения аналитическойчувствительности на стадии выходного контроля наборов реагентов.93Клинические испытания набора проводились га основании разрешенияРосздравнадзораовозможностипроведенияклиническихиспытаниймедицинского изделия - Набор реагентов для обнаружения РНК вируса Зика (Zikavirus) методом полимеразной цепной реакции «ФЛАВИСКРИН-ZIKV» № 514/216от 16.06.2016.Местом проведения испытаний был выбран НИИ гриппа Министерстваздравоохранения Российской Федерации (г.
Санкт-Петербург).В соответствии с Приказом Минздрава РФ от 9 января 2014г. №2н,согласованная сторонами программа клинических испытаний включала:анализ представленной документации;проведениеклинико-лабораторныхиспытаний,необходимыхдляприменения медицинского изделия по назначению;оценку и анализ полученных данных и их соответствие заявленнымхарактеристикам;доработкуэксплуатационнойдокументациипроизводителяпорезультатам испытаний (при необходимости);оформление и выдача заявителю акта оценки результатов клинико-лабораторных испытаний.Клинико-лабораторные испытания состояли из следующих этапов:1) соответствиеаналитическиххарактеристикиспытуемогонаборазаявленным в технической и эксплуатационной документации;2) оценка внешнего вида упаковки и маркировки и соответствие этихпоказателей качества указаны в технической и эксплуатационной нормативнойдокументации испытуемого набора;3) определение диагностических характеристик набора (чувствительностии специфичности);4) экспериментальная апробация инструкции по применению испытуемогонабора;5) анализклиническойбезопасностисогласноапробации инструкции по применению испытуемого набора;экспериментальной946) сравнение результатов с помощью набора сравнения «АмплиСенс ® Zikavirus-FL», ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия.7) оценка воспроизводимости испытуемого набора.Подготовка и инактивация проб проводилась в Федеральном научномЦентре исследований и разработки иммунобиологических препаратов им.
М.П.Чумакова РАН, имеющим лицензию на осуществление деятельности, связанной сиспользованиемвозбудителейинфекционныхзаболеваний1-4групппатогенности, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.3118-13«Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)»,СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращениюсмедицинскимиотходами»иметодическихуказанийМУ1.3.2569-09«Организация работы лабораторий, использующих методы амплификациинуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IVгрупп патогенности».Во время клинических испытаний набора реагентов для обнаружения РНКвируса Зика (Zika virus) в биологическом материале методом полимеразнойцепной реакции (ПЦР) «ФЛАВИСКРИН-ZIKV» для диагностики in vitroпроизводства ООО НПФ «Литех» проведена проверка полноты и достоверностиустановленных технической и эксплуатационной документацией производителязаявленных характеристик безопасности и эффективности испытуемого набора всоответствии с предназначенным производителем применением медицинскогоизделия по назначению, в том числе, определение его аналитических идиагностических характеристик, указанных в технической и эксплуатационнойдокументации производителя.5.3.
Эпидемиологическая диагностика в потенциальных и активных очагахмалярииВ настоящее время 55% всех случаев малярии вызываются Plasmodiumvivax, ежегодно в мире заболевают трехдневной малярией 75 млн. человек. Этислучаи возникают в азиатской части Европейского региона, в Центральной и95Юго-Восточной Азии, на Ближнем Востоке, в Центральной и Южной Америке,менее всего - в Африке. На многих территориях ареалы P.vivax и P.falciparumсовпадают, хотя у этих возбудителей резко отличаются биологические иэпидемиологические характеристики.
На территориях с низким уровнем передачиP.vivax неизменно становится доминирующим возбудителем. Этому способствуетзначительно более раннее по сравнению с P. falciparum появление гаметоцитовP.vivax в крови больных: на 3-4 дни болезни, тогда как при тропической малярии– на 9-10 дни. Известно также, что больные трехдневной малярией становятсязаразными для переносчика еще в конце инкубационного периода до развитияпервых клинических проявлений, а заболевания новорожденных возникают дажес первых дней жизни; заражение P.falciparum регистрируются после 6 месяцевжизни.Изучение популяционной структуры возбудителя малярии необходимо дляпонимания роли полиморфизма возбудителя в передаче малярии. Такаяинформация особенно актуальна, так как часто регистрируется микст-инфекцииразными генетическими вариантами P.vivaх. В прежде эндемичных странах СНГ(Республики Кыргызстан и Таджикистан) в 2005-2010 гг.
впервые былипроведены генетические исследования завозной тропической и местной виваксмалярии. Их целью стало изучение молекулярно-генетической структурыпопуляций возбудителя трехдневной малярии по маркерной области генома –области гена белка оболочки I мерозоита Plasmodium vivax.Материал для нашего исследования был собран в июле-октябре 2006 г. в 2-хгородах и 3-х селениях Республики Кыргызстан (г. Бишкек, г. ТашкумырЖалалабадского вилоята, с. Кора-Бок, с.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
