Диссертация (1139664), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Использование ПЦР позволяет при наличии одного термоциклеравыполнить эту работу одному человеку за один рабочий день.3.1.1. Диагностические исследованияВ настоящее время нами разработаны и внедрены в НИИМПиТМим.Е.И.Марциновского методики ПЦР диагностики всех 4-х видов малярийныхпаразитов. ПЦР диагностика малярии может использоваться в сложных испорных случаях, а также при плохом качестве приготовления препаратов крови(аутофиксация,дефектыокраски).Особеннуюценностьпредставляетразработанный в Институте метод выделения ДНК из препаратов крови толстаякапля, ранее использовавшихся в микроскопической диагностике малярии. Этотметод внедрен и широко используется в работе федерального Референс-центра подиагностике малярии Минздрава России.62Для детекции ДНК малярийных паразитов были применены праймеры,комплементарные к ДНК рода Plasmodium, а также к 4-м видам малярийныхпаразитов человека.
В настоящее время, в связи с выявлением в странах ЮгоВосточной Азии «пятого вида» малярии человека, вызываемого P. knowlesi(возбудитель малярии обезьян), разрабатываются видоспецифичные праймеры кэтому виду [129].По препаратам толстая капля крови с микроскопически подтвержденнымналичием в них малярийных паразитов установлено, что данные препараты могутслужить надежным источником ДНК плазмодиев [18, 52]. Следует подчеркнуть,что качество препарата и срок его хранения практически не влияют на качествоПЦР диагностики (таблица 3.1.1.1).Таблица 3.1.1.1Использование в качестве источника ДНК препаратов маляриитолстая капля с разными сроками храненияСрокКоличествоПодтверждениеПримечанияхранения препаратовдиагноза маляриипрепаратаМикроскопически ПЦРМеньше 1252525-1-2 года232323-3-5 лет303030-6-10 лет282828-11-15 лет21212016-20 лет222220Более 20лет222219Всетолстыекапли,положительныевмикроскопиииотрицательные в ПЦР имеливидимыеповреждения,возникшиеврезультатечастого их просмотрагодаДля идентификации возбудителей малярии рода Plasmodium проводилиПЦР с праймерами PLU1 5’-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3’ и PLU5 5’-63CCTGGTGTTGCCTTAAACTTC-3’, специфичными к гену 18S РНК всехпредставителей рода.
Для видовой идентификации P. vivax и P. falciparum ПЦРпроводили с праймерамиVIV1 5’- CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC-3’ иVIV2 5’-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA-3’, специфичными кгену 18S РНК P. vivax, и праймерамиrFAL1 5’-TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT-3’ иrFAL2 5’-ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC-3’, специфичными кгену 18S РНК P. vivax и P. falciparum.ДляизучениягенетическойструктурыпопуляцийP.vivaxбылииспользованы праймеры, специфические к участку гена msp-1 белка оболочкимерозоита MSP1. Реакция амплификации с праймерамиА5 5'-GGGAATTCTACTACTTGATGGTCCTC-3' в качестве прямого иA6 5'-CCTTCTGGTACAGCTCAATG-3' в качестве обратного была проведена поусловиям, описанным ранее. Результаты ПЦР визуализировали методомэлектрофореза в 1% агарозном геле.
Очистка ПЦР-продукта для секвенированияпроводилась с использованием набора для элюции QIAquik Gel Extraction Kit(QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. ОчищенныйПЦР-продукт был секвенирован с обеих цепей. Нуклеотидные последовательности,полученные в результате секвенирования, сравнивали и выравнивали споследовательностямибазыданныхGeneBankспомощьюпакетафилогенетических программ CLUSTALWX1,83.
Характеристика праймеров,отобранных для наших исследований для всех видов Plasmodium и режимыамплификации суммированы в таблицах 3.1.1.2. и 3.1.1.3.64Таблица 3.1.1.2Характеристика праймеров, использованных для Nested ПЦР1и Nested ПЦР2 при диагностике рода и видов PlasmodiumТиппраймераУсловноеобозначениеРодPlasmodiumNest 1PLU 5P.falciparumNest2FAL1PLU 6FAL2P.vivaxNest2VIV1VIV2P. malariaeNest2MAL1MAL2P.ovaleNest2OVA1OVA2* bp – пара основанияПоследовательностьолигонуклеотидовРазмерпродуктаПЦР5’-CCT GTT GTT GCC TTAAAC TTC-3’ ( 21 bp.)~1200bp*.5’-TTA AAA TTG TTG CAGTTA AAA CG-3’ (23 bp.)5’-TTA AAC TGG TTT GGGAAA ACC AAA TAT ATT-3’ (30bp.)5’-ACA CAA TGA ACT CAATCA TGA CTA CCC GTC-3’( 30bp.)5’-CGC TTC TAG CTT AATCCA CAT AAC TGATAC-3’ (30bp.)5’-ACT TCC AAG CCG AAGCAA AGA AAG TCC TTA-3’ (30bp.)5’-ATA ACA TAG TTG TACGTT AAG AAT AAC CGC-3’ (30bp.)5’-AAA ATT CCC ATG CATAAA AAA TTA TAC AAA-3’ (30bp.)5’-ATC TCT TTT GCT ATT TTTTAG TAT TGG AGA-3’ (30 bp.)5’-GGA AAA GGA CAC ATTAAT TGT ATC CTA GTG-3’ (30bp.)205 bp.120 bp.144 bp.~800 bp.65Таблица 3.1.1.3Оптимизированные режимы амплификацииСтадияРежимНачальная денатурация95С – 5 минДенатурация95С – 1 мин.Отжиг праймеров53С – 2 мин.Удлинение72С – 2 минКонечное удлинение72С – 8 минКоличество циклов амплификации25В качестве перехода к более современному методу ПЦР-диагностики –ПЦР в реальном времени был предложен метод одноэтапной ПЦР, которая придобавлении реагента SybrGreen, а также наличия соответствующей приборнойбазы, может проходить с флюоресцентной детекцией в реальном времени.
Дляидентификации возбудителей малярии проводили ПЦР родоспецифичнымипраймерамиPLU65’-TТAAAАТТGТТGCAGTTAAAACG-3’иPLU55’-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3’, специфичными к гену 18S РНК родаPlasmodium. Для постановки видоспецифичного диагноза P.vivax проводиласьамплификацияVIV15’-техжеобразцовДНКсCGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC-3’праймерамииVIV25’-ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA-3’, специфичными к гену 18SРНК P. vivax, праймерами VDTOF 5’-ATG GAG GAC CTT TCA GAT GTA TTTGAC ATT-3’ и VDFOR 5’-CTTGCTGTAAACCAAAAAGTCCA-3’, специфичнымик фрагменту гена дегидрофолатдегидрогеназы. Эксперимент показал высокуючувствительность данной модификации ПЦР.
С целью определения результатареакции был выполнен электрофорез в агарозном геле (рисунок 3.1.1.1.).Экспериментпоказалвоспроизводимостьреакции,ееспецифичностьичувствительность, а также возможность диагностики малярии методом ПЦР вреальном времени. Таким образом, в зависимости от наличия оборудования в66лаборатории можно проводить молекулярную диагностику малярии двумяразличными модификациями полимеразной цепной реакции.12345678910 11 12 13 14 15 16 17Рисунок 3.1.1.1.Фотография электрофореза ПЦР малярии (линии 1 – 9и 11 – 17 положительные образцы от больных малярией, линия 10 –стандартный маркер)3.1.2. Поиск межштаммовых различийВ настоящее время возбудители малярии представляют особый интересдля научного сообщества.
Особенно интересным и заслуживающим вниманияоказался тот факт, что повторяющиеся рибосомные гены, являющиеся у другихорганизмов продуктом согласованной эволюции, в случае малярийного плазмодияотносительно малокопийны и представлены сильно отличающимися блоками,каждый из которых транскрибируется на определенной стадии жизненного цикла[29]. Таким образом, жизненный цикл малярийных плазмодиев тесно связан сфункционированием рибосом, специфичных для каждой стадии жизненногоцикла. Отличия между рибосомными генами разных типов у каждого видаплазмодиев столь существенны, что превышают таковые межвидовые различиямежду генами одного типа у разных видов плазмодиев.
Рибосомы каждой изстадий отличаются по структуре и функциональной активности. В ходе развитиямалярийногопаразитаобразованиерибосомрегулируетсянауровнетранскрипции трех различных типов 18S рДНК – A, S и О, транскрибируемых на67стадиях эритроцитарной шизогонии, спорогонии и формирования оокинетысоответственно. Рибосомные гены представлены 4-8 рибосомными оперонами,которые разбросаны по различным участкам генома.
Накопление мутаций врибосомных генах разных типов у малярийных паразитов происходит независимодруг от друга и с большой скоростью, не свойственной другим организмам, чтоявляет собой пример исключения из гипотезы согласованной эволюциирибосомных генов [29]. Уровни дивергенции и направление эволюционныхпроцессов между структурно детерминированными (ген 18S рРНК) и менеефункциональнозначимымиучастками(внутреннимитранскрибируемымиспейсерами – ITS1 и ITS 2) могут варьировать.3.2.
ЛейшманиозыВпоследнеевремяувеличилосьчислорегистрируемыхслучаевлейшманиозов у людей в мире, что связано с расширением ареалов возбудителейи переносчиков, с распространением паразитов в новые географические зоны[137, 152, 166, 174, 190]. Лейшманиозы являются оппортунистическойинфекцией у лиц с иммунодефицитом, что изменило привычную эпидемическуюкартину [82, 127, 128, 177, 184].В связи с возрастанием числа международных путешествий, являющихсяпричиной завоза паразитов, лейшманиозы регулярно диагностируют в регионах,где данная инфекция неэндемична. Диагноз может быть поставлен путемобнаружения паразита при микроскопии и при помощи серологических методов.Висцеральные лейшманиозы обычно диагностируют с применениемиммуносорбентного теста (ELISA) у иммунокомпетентных пациентов [205].Однако чувствительность серологических методов у пациентов соСПИДом колеблется, по данным различных исследований, от 6 до 82%.Прямоеобнаружениепаразиталучшевсегодостигаетсяпутеммультипликации промастиготных форм in vitro.
Этот метод является болеечувствительным, чем микроскопическое исследование биопсийного материала.Более того, культивирование in vitro позволяет более подробно изучить культуру68посредствомизоферментноготестаиполучитьважныесведенияочувствительности культуры к химиотерапии.Однако культивирование in vitro может быть проведено только приналичии нативного материала.Альтернативнымметодомдиагностикиявляетсяидентификациявозбудителя при помощи молекулярно-биологических методов, таких какспецифические ДНК-зонды, или ПЦР.БыливыделенынесколькоДНКмишеней,иихценностьдляиспользования в ПЦР-диагностике постепенно возрастает.В данный момент применение метода ПЦР оптимизировано дляиспользования в рутинной клинической диагностике.
В результате быливыбраны следующие праймеры для детекции паразитов Leishmania infantum.Прямой праймер - LITSR - CTGGATCATTTTCCGATG;Обратный праймер – L5.8S - TGATACCACTTATCGCACTT.Экспериментальнымпутембылоустановлено,чтооптимальнойтемпературой отжига праймеров является 53º С. Для увеличения количествапродукта ПЦР количество циклов амплификации увеличили до 40.В результате проведенной оптимизации температуры отжига праймеров ивремени элонгации был выбран следующий режим амплификации (таблица3.2.1.).Таблица 3.2.1Оптимизированные режимы амплификацииСтадияРежимНачальная денатурация95С – 2 минДенатурация95С – 20 сек.Отжиг праймеров53С – 30 сек.Удлинение72С – 1 минКонечное удлинение72С – 6 минКоличество циклов амплификации4069Визуализация продукта ПЦР проводилась в 1,5 % агарозном геле,окрашенном бромистым этидием.При оценке результата ПЦР ожидаемый размер продукта (относительномаркера) для L.infantum - 400 - 451 в.
р.3.3. ТрипаносомозыВозбудители африканского и американского трипаносомозов, как и другиекровепаразиты, могут быть легко диагностированы методом ПЦР по цельнойкрови, крови, собранной на бумажные фильтры, а также по препаратам кровитолстая капля, окрашенным по Романовскому-Гимза. В литературе представленобольшое число праймеров как для T.
cruzi, так и для T. gambiensi. Эта проблемастановится актуальной в связи с появлением в Европе завозных случаевтрипаносомозов после посещения эндемичных территорий в тропиках [91, 118].3.4. ДирофиляриозДирофиляриоз представляет собой уникальный для России гельминтоз,возбудителькоторогоналичиночнойстадииразвиваетсяворганизмепереносчиков – комаров родов Culex, Anopheles и Aedes [13, 110]. До недавнеговремени проблеме выявления, лечения и профилактики дирофиляриоза в нашейстране уделялось мало внимания [97]. Считалось, что это весьма редкий, неимеющий существенного медицинского значения гельминтоз, который восновном завозится к нам из других стран с более теплым климатом [3, 53].В последние 5 лет число больных, зарегистрированных в РФ, превысило200 чел.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
