Диссертация (1139664), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Разработкой ноутбуков данной категории занимаетсякомпания Panasonic, которая самостоятельно осуществляет разработку ипроизводство ноутбуков серии TOUGHBOOK .Ноутбуки Panasonic широко применяются для автоматизации работ вполевых и промышленных условиях по всему миру: в армиях и службах силовыхструктур, предприятиях добывающего сектора, строительной отрасли, натранспорте, в машиностроении, автомобильной промышленности, геологии,биологии и т.д.Однакомынепаразитологическойпроизводителей,исключаемлабораторииеслионовозможностькомпьютернымотвечаетвсемоснащениямобильнойоборудованиемзаявляемымдругихтехническимитехнологическим требованиям. В соответствии с разработанной нами всодружестве со специалистами Московского физико-технического институтарабочей технической документацией для данной лаборатории предлагаетсяиспользовать компьютер типа Panasonic Toughbook CF-53, который прошелиспытания на защищенность в лаборатории Panasonic (9 различных тестовзащищенности), выдерживает падение с высоты 76 см, клавиатура защищена отпроливов жидкости.Вмобильнойлабораториипредусмотренмонтажлокальнойвычислительной компьютерной сети, с подключением к автоматизированнойинформационно-справочнойсистеме,содержащейподсистемуведенияэлектронных историй болезни и автоматизированной системы хранения и поискаданных лабораторных исследований.Сеть включает в свой состав автоматизированное рабочее место врачадиагноста(биолога),выполненноеконструктивнонабазекарманногомикрокомпьютера в виде носимого комплекта диагностики, содержащегомикроинтегральную плату программного алгоритма, блок для применения132иммуноферментного, иммунофлуоресцентного анализа и блок амплификациинуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции.Локальная сеть содержит один сегмент, состоящий из проводной части идвух беспроводных радиосетей стандарта IEEE 802.11b/g/n/ac на частотах 2.4ГГци 5ГГц.
Сеть развернута на базе маршрутизатора ASUS RT-AC66R.133ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕНачало ХХI века характеризуется появлением новых для нашей страныпотенциально опасных паразитарных болезней и инвазивных переносчиков,способных передавать экзотических для России возбудителей тропическихарбовирусных лихорадок и возникновением лекарственной устойчивости увозбудителей ряда паразитарных болезнейк лекарственным препаратам.
Этоприводит к значительному удорожанию лечения и борьбы с такими болезнями, сдругой стороны диктует настоятельную необходимость создания и широкогоиспользования новых более чувствительных, эффективных и экономичныхметодов диагностики. Одним из возможных путей решения этой важнойсоциально-экономической проблемы должны стать разработка и внедрение впрактику здравоохранения и Государственного санитарно-эпидемиологическогонадзорамолекулярно-биологическихметодовиндикациииэкспресс-идентификации геномов эпидемически опасных паразитарных патогенов или ихфрагментов непосредственно в клиническом материале без длительной стадиикультивирования и получения чистых культур возбудителей.
Оптимальнымрешением для сформулированных задач представляется разработка широкогоспектра диагностикумов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).Различные варианты исполнения ПЦР требуют разных трудозатрат и времени дляполучения конечного результата, поскольку необходимо использовать разное понабору и стоимости оборудование.
Это предполагает, что в зависимости отконкретных целей на разных уровнях структуры практического здравоохраненияиоргановучрежденийГосударственногосанитарно-эпидемиологическогонадзора, можно будет создавать оптимальные наборы оборудования для наиболееэкономного оснащения соответствующих лабораторий или использования ужесуществующих в системе практического здравоохранения или РоспотребнадзораПЦР-лабораторий.134Наибольшая протребность в новых методах молекулярной диагностикисуществует в области трансмиссивных паразитозов: малярии, лейшманиозов идирофиляриозов. Это связано с тем, что ПЦР в этом случае будет использована нетолько как диагностический инструмент, но и как эффективная методологияпоиска генетических различий между штаммами (малярия), видами и подвидами(лейшманиозы), а также обнаружения паразитов в переносчике (дирофиляриозы).В этих случаях ПЦР используется как предварительный метод передприменением прямого секвенирования или других молекулярно-генетическихметодов [56].Применение ПЦР при диагностике малярии и лейшманиозов имеет особуюценность в условиях референс-центров, так как дает возможность накоплениязначительных количеств препаратов, присланных на контроль.
При примененииПЦР в референс-центре используется методика выделения ДНК паразита изпрепаратов крови толстая капля, ранее окрашенных по Романовскому-Гимза,разработаннаявНИИМПиТМим.Е.И.Марциновского[56].Высокаячувствительность ПЦР дает большие преимущества для выявления скрытыхисточниковинфекцииссубклиническойпаразитемией,например,прирасследовании случаев прививной малярии у реципиентов крови или срединаркоманов, а также для поиска источников инфекции в очагах с местнойпередачей при элиминации малярии.
Кроме того, ПЦР позволяет легко выявитьсмешаннуюинфекцию,чтовызываетопределенныесложностимикроскопическими методами, поскольку при микст-инфекции один из видов(P.falciparum) обычно превалирует и маскирует единичных паразитов другоговида.Сформулированный подход чрезвычайно важен и для некоторых нозоформнетрансмиссивных паразитозов, например, амебиаза. Быстрая и надежнаядифференциация патогенной инвазивной E.histolytica от комменсалов E.dispar илиE.moshkovskyневозможнана основеморфологическихмикроскопическихисследований. Для осуществления дифференциальной диагностики подобного,135критически важного для постановки диагноза возбудителя и определения тактикилечения, необходимо использование молекулярно-биологических технологий.Ограничения применения ПЦР при рутинной диагностике паразитозовсвязаны со сложным жизненным циклом паразитов, когда паразит на разныхстадиях жизненного цикла изменяет свою локализацию в организме хозяина иневозможно определить, какой материал оптимально пригоден для исследования.Так, например, применение ПЦР диагностики у больных геогельминтозаминецелесообразно,посколькумикроскопиядаетдостаточнобыстрыйвидоспецифический результат.
Наши исследования показали, что применениеПЦРпригеогельминтозахвозможноприпроведениисанитарно-паразитологических исследований. В этом случае постановка ПЦР позволяетзначительно сократить трудозатраты [56]. Для оптимизации ПЦР диагностикипаразитозов нами были обобщены в виде таблицы данные о возможностиприменения различного клинического материала в качестве источника ДНК наразных стадиях развития паразитов в организме человека (Приложение 3).Значительное сокращение трудозатрат при постановке ПЦР в сравнении сдругими методами достигается только при массовых обследованиях так каквремя, необходимое для постановки 1 или 50 проб, отличается не более чем на10%.
Еще более значительного сокращения трудозатрат удается добиться приприменении ПЦР в реальном времени, поскольку при применении этого методаотсутствует стадия электрофореза, а длительность ПЦР сокращена до 1 часа.Таким образом, молекулярно биологические методы имеют значительныеперспективы в паразитологии как в научных исследованиях, так и впрактическом здравоохранении [56].Обобщено указанное новое для медицинской паразитологии научноенаправление мы обозначили как «молекулярная паразитология».
Подключениеметодологии молекулярной биологии и молекулярной медицины к изучениюпаразитарныхболезнейвперспективедолжнопривестиксозданиюпринципиально новых способов диагностики, лечения и профилактики этойсоциальнозначимойпатологии.Расшифровкамолекулярныхмеханизмов136взаимодействия паразита и хозяина позволит направленно конструироватьинструменты управления патогенезом различных паразитозов и модулироватьзащитные системы организма хозяина. Уже сейчас начинают создаватьсялекарственные препараты для «таргетной терапии» некоторых гельминтозов.Именно такой подход образно сформулировал лауреат Нобелевской премии Дж.Ледерберг, указав, что «в гонке за выживание с микробными генами нашиморужием должен стать человеческий разум, а не естественный отбор нашихгенов» [88].Настоящая диссертация содержит результаты разработанной методологиимониторингазасоциальнозначимымипаразитарнымиболезнямисиспользованием ПЦР-технологий в рамках сформулированной концепции«молекулярной паразитологии»В области молекулярно-биологической диагностики трансмиссивныхпаразитозов была разработана оригинальная технология ПЦР-диагностикималярии на основе выделения ДНК из препарата крови «толстая капля».Определены оптимальные режимы постановки ПЦР-диагностики малярии.Предложен метод одноэтапной ПЦР с использованием флуоресцентной детекциив реальном времени.
Доказано, что качество и сроки хранения препарата «толстаякапля» не влияют на результаты ПЦР-диагностики.УсовершенствованаметодикапостановкиПЦРдлядиагностикивисцерального лейшманиоза. Экспериментальным путем была установленаоптимальнаятемператураотжигапраймеров–530Сичислоцикловамплификации (40), обеспечивающих получение наибольшего количества ПЦРпродукта.Выбраны и синтезированы праймеры для диагностики Dirofilaria repens иD.immitis. Подобраны наиболее эффективные режимы амплификации для этихпраймеров. Использование созданных нами ПЦР-диагностикумов дирофиляриозадоказало свою эффективность в диагностике подкожного дирофиляриозачеловека. С использованием наших праймеров впревые в России удалось выявитьзаболевание человека системным дирофиляриозом, вызванным D.immitis.137Новым важным для задач эпидемиологического надзора за паразитарнымиболезнями стала разработка методологии определения уровня зараженностидирофиляриями переносчиков – комаров родов Culex, Aedes и Anopheles на основепостановки ПЦР.Сцельюоптимизациимониторингаиэкспрессдиагностикинетрансмиссивных паразитозовбыли выбраны праймеры для обнаружения геномакриптоспоридий и лямблий в клиническом материале, питьевой воде и объектахсреды обитания человека.
Показано, что для Cryptosporidium parvum оптимальнойтемпературой отжига является 450С, число циклов амплификации – 35.Соответствующие параметры для Lamblia intestinalis составили – 620С и 45циклов амплификации.Праймеры для диагностики амебиаза подбирали по базам данныхгенетической информации Genbank с помощью компьютерной программы Blast онуклеотидной последовательности генома Entamoeba histolyticaи по материаламсобственных клинических исследований. В результате были выбраны прямой иобратный праймеры. Экспериментальным путем было установлено, что длядетекции паразитов Entamoeba histolytica оптимальной температурой отжигапраймеров является 650С, а увеличение количества продукта ПЦР достигается при35 циклах амплификации.Принципиально новые для науки данные были получены нами и другимисотрудниками НИИМПиТМ им.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
