Диссертация (1139646), страница 16
Текст из файла (страница 16)
При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтовузнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, которыйсодержал не менее трех-четырех HpaII или HhaI сайтов. В случае модификациицитозинов в метилцитозин ДНК не гидролизуется, и продукт ПЦР может бытьвыявлен в геле. В отсутствие метилирования сайтов узнавания для используемыхрестриктаз, ДНК полностью гидролизуется, и продукт ПЦР не образуется.Для исключения ложноотрицательных результатов проводили мультилокусныеПЦР с тремя парами праймеров: один фрагмент принадлежал изучаемому гену(MGMT, CDH1, р16/ CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3), другой служил внутреннимконтролем ПЦР (фрагмент гена XL 3.2 или фрагмент гена CUX1, не содержащиесайтов узнавания указанных рестриктаз), а третий фрагмент соответствовал генуING1, и служил контролем полноты гидролиза.
ПЦР проводили по следующей схеме:к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМкаждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимеразы, 50 мкл однократного91буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 5 мМMgCl2, 10% диметилсульфоксида. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла,прогревали смесь при температуре 950С градусов в течение 10 мин и проводили 33цикла по следующей программе: денатурация при 950С – 30 с, отжиг и элонгация притемпературе 58-620С градусов – 2 мин 30 с (табл.16).Таблица 16Праймеры для исследуемых генов, режимы их отжига и размеры получаемыхфрагментов.Исследуемый генMGMTСDH1р16/CDKN2ADAPKRAR-βRUNX3ING1XL3.2CUX1НуклеотиднаяпоследовательностьпраймеровF: tgc cgg cgt cca gcg agg atgR: agg cga ccc aga cac tca ccaF: gccccatctccaaaacgaacaR: tcctccgtatcactt ccc ccaF: gaa cgc act caa aca cgcR: agc cag ccc c ctc ttt ctt cF:ggg cag ctt agc aat gtg tcR:aca ctc cga agc agc ctc tcF: cat ttg aag gtt agc agc cccR: cat tta cca ttt tcc agg ctF: ggc aac ccc gtt aaa agt catR: ctt caa ggt gag tgc ggg aF: gcg cca gcc ccg ccg cct gagR: tgc cga gcc cgt ccg ccg cctF: ttg gct agc agc aac agt gcR: agt ttg atg gct tct gtg atF: gcc ccc gag gac gcc gct accR: aag cgg tcc agg ggt cca ggc92Условия ПЦРРазмерпродукта п.н.Tотж.MgCl2(mM)67оС3,034660оС3,036160оС3,035260оС3,038060оС3,036060оС3,025065 оС3,033560оС3,018067 оС3,0450Рисунок 7.
Примеры определения метилирования генов MGMT, CDH1,CDKN2A, DAPK, RAR-β и RUNX3 методом МЧ-ПЦРр16/На рисунке 7 цифрами обозначены ДНК пациентов с ПБ; положительный сигналпоказан стрелкой и в положительных дорожках обозначен звездочками. На гелефрагмент соответствующий метилированной форме гена и внутренний контроль ПЦР.2.5. Изучение результатов хирургического лечения.Изучение непосредственных результатовВсем пациентам после антирефлюксных и реконструктивных операций накардии в течение первых суток в отделении реанимации проводили обзорнуюрентгенографию грудной клетки для исключения пневмо- и гидроторакса, УЗИбрюшной полости для выявления скоплений жидкости.
Больным после экстирпациипищевода эти исследования повторяли ежедневно в течение всего периодапребывания в отделении реанимации.Рентгенологическое исследование с водорастворимым контрастным веществом(урографин) проводили на 3-4 сутки пациентам первой и второй групп. При этомоценивали проходимость области сформированной манжетки, ее состоятельность,наличие газового пузыря, время эвакуации из желудка, наличие деформаций. После93экстирпации пищевода рентгенологический контроль состоятельности анастомозапроводили на 4-5 сутки.Также регистрировали все возникающие осложнения и изменения в состояниипациентов.
При необходимости проводили дополнительное обследование (МСКТ,МРТ, ЭХОКГ, консультации смежных специалистов).Изучение отдаленных результатовИзучение отдаленных результатов с целью максимальной объективизации идостоверности данных проводили как традиционным способом (результаты клиникоинструментального обследования), так и путем изучения мнения самих пациентов –оценки качества жизни лперированных больных. Было обследовано 303 (79,7%)пациента после антирефлюксных операций.
Анализ отдаленных результатовначинали с опроса и выяснения жалоб пациентов. При этом особое внимание уделялижалобам, характерным для рефлюкс-эзофагита (изжога, дисфагия, боль, отрыжка,тошнота, регургитация и др.) и возможных осложнений (дисфагия, рвота, вздутиеживота и др.). В план обследования входило рентгенологическое исследование,ЭГДС,анкетирование.Вслучаесомнительныхситуаций(несоответствиеклинических и инструментальных показателей) проводили рН-импедансометрию,манометрию и консультировали пациентов с психиатрами.Все больные былиобследованы в сроки от 6 месяцев до 10 лет.Эндоскопическое исследование проводили не ранее чем через 6 месяцев послеоперации, поскольку в более ранние сроки могут сохраняться воспалительныеизменения в дистальном отделе пищевода. Всем пациентам с диагностированным дооперации пищеводом Барретта в обязательном порядке повторяли биопсию сгистологическим и молекулярно-генетическим исследованием спустя не менее 6месяцев.Всепациенты,контрольноеоперированныеобследование(МСКТпоповодугрудной94иаденокарциномыбрюшнойпроходилиполостисв/вконтрастированием, ЭГДС) через 3-4 месяца, далее через 6 месяцев .
В дальнейшемоценивали5-летнюювыживаемостьпотелефону,атакжепроведенноедополнительное лечение – адьювантная химиотерапия (схема, количество курсов).До недавнего времени определение эффективности хирургических методовлечения осуществлялось в основном по таким традиционным статистическимпоказателям, как летальность, продолжительность пребывания в стационаре, наличиепослеоперационных осложнений, а также частота и степень выраженности различныхрасстройств, регистрируемых лабораторными и инструментальными методамиисследований.
Перечисленные показатели, оцениваемые самим врачом, в полной мерене отвечают современным требованиям изучения отдаленных результатов лечения,так как не учитывают изменения качества жизни оперированных больных [7,23,36,37].К тому же известно, что оценка качества жизни оперированного больного,проведенная раздельно врачом и пациентом, не совпадает в 40-60% наблюдений [23].Только исследование качества жизни с учетом современных международныхтребований и в сочетании с изучением медицинских заключений обследованияпозволяют полноценно, всесторонне и объективно оценить результат проведенноголечения.
Известно также, что параметры качества жизни обладают независимойпрогностической значимостью и являются наиболее точными факторами прогнозауспешного лечения пациента, нежели общесоматический статус [7,23,36].Для изучения качества жизни использовали опросники RAND SF-36 и GSRS(GastrointestinalSymptomRatingScale).RANDSF-36являетсянаиболеераспространенным валидизированным общим опросником, который широкоиспользуется у пацентов с различными заболеваниями [246]. Ответы пациентов послепроцедуры шкалирования переводят в баллы по шкале от 0 до 100. Чем выше балл пошкале, тем выше уровень качества жизни.
Ответы на вопросы представляют в видеследующих шкал: Количественно оценивали следующие показатели:1. General Health (GH) – общее состояние здоровья - оценка больным своего состоянияздоровья в настоящий момент и перспектив лечения.952. Physical Functioning (PF) – физическое функционирование, отражающее степень, вкоторой здоровье лимитирует выполнение физических нагрузок (самообслуживание,ходьба, подъем по лестнице, переноска тяжестей и т.п.).3. Role-Physical (RP) - влияние физического состояния на ролевое функционирование(работу, выполнение будничной деятельности).4. Role-Emotional (RE)-влияние эмоционального состоянияна ролевоефункционирование, предполагает оценку степени, в которой эмоциональноесостояние мешает выполнению работы или другой повседневной деятельности(включая увеличение затрат времени, уменьшение объема выполненной работы,снижение качества ее выполнения и т.п.).5.
Social Functioning (SF) - социальное функционирование, определяется степенью, вкоторой физическое или эмоциональное состояние ограничивает социальнуюактивность (общение).6. Bodily Pain (BP) - интенсивность боли и ее влияние на способность заниматьсяповседневной деятельностью, включая работу по дому и вне дома.7.
Vitality (VT) - жизнеспособность (подразумевает ощущение себя полным сил иэнергии или, напротив, обессиленным).8. Mental Health (MH) - самооценка психического здоровья, характеризует настроение(наличие депрессии, тревоги, общий показатель положительных эмоций).Используемый опросник GSRS (Gastrointestinal Symptom Rating Scale) являетсяспециальным инструментом оценки качества жизни, применяемым при заболеванияхжелудочно-кишечного тракта, и позволяет количественно оценить выраженностьразличных гастроэнтерологических симптомов [204].
Опросник GSRS содержитперечень вопросов о самочувствии больных, связанных с абдоминальной болью,рефлюкс-синдромом, диарейным синдромом, диспепсическим синдромом и запорамив течение предшествующей опросу недели. Ответы на вопросы демонстрируютинтенсивность симптомов и колеблются от 1 (отсутствие симптома) до 7 (сильнобеспокоящий симптом). Более высокие значения соответствуют более выраженным96симптомам и более низкому качеству жизни. Оба опросника имеют русскоязычныевалидизированные версии, прошедшие все этапы апробации в России.Статистический анализ включал данные описательной статистики и оценкустатистической значимости различий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
