Диссертация (1139554), страница 30
Текст из файла (страница 30)
даже при увеличении в сыворотке MICA экспрессия NKG2D не будетзначимо ингибироваться. Наши результаты свидетельствуют о том, что предложенный метод культивирования клеток для АИТ позволяет сохранить цитотоксическую активность NK-клеток даже в присутствии высоких концентрацийsMICA. Этот подход необходим для активации противоопухолевого звена иммунитета и более эффективного уничтожения опухолевых клеток. Экспериментальные данные указывают на наличие опосредованных NKG2D механизмов в регуляции функций естественных киллеров при взаимодействии с опухолевымиклетками экспрессирующими лиганды NKG2D и растворимыми формами этихмолекул как у здоровых доноров, так и у онкологических больных, в то же время,по-видимому, NKG2D-зависимый путь киллинга не является единственным.Данные клинических исследований были подтверждены нами экспериментально.
Было показано, что высокая цитотоксическая активность наблюдается улимфоцитов in vitro после активации, однако блокирование рецептора NKG2D154белком MICA приводило к снижению функциональной активности эффекторных клеток, что вероятно и имеет место у онкологических больных. Некоторымиисследователями показано, что только 11,4% клеток К562 экспрессируют молекулы MICA [172]. Другая часть лигандов NKG2D представлена молекуламиULBP1-2.
Блокировка поверхностной экспрессии NKG2D приводит к ингибированию и этого лиганд-рецепторного взаимодействия. В других экспериментальных статьях показано, что противоопухолевая активность NK-клеток не зависитот происхождения и типа роста клеток-мишеней, а определяется лишь наличиемповерхностных маркеров на клетке-мишени [98]. При стимуляции лимфоцитовin vitro опухолевые клетки становились более восприимчивыми к цитолизу, в томчисле за счет повышения экспрессии рецептора NKG2D на лимфоцитах, что приводит к усилению цитолитической активности NK-клеток.
Именно поэтому важен механизм экспрессии и сбрасывания лигандов NKG2D, что приводит к активации или анергии эффекторов.4.2. Культивирование лимфоцитов in vitro с IL-2 и IL-15В данном исследовании, основываясь на данных по активации лимфоцитов и получению ЛАК-клеток в культуральной среде с добавлением низкихконцентраций IL-2, нами была разработана методика получения ЦИК-клеток.Для этого мы дополнительно использовали IL-15, который в большей степенивлияет на активацию лимфоцитов-эффекторов.4.2.1.
Оценка пролиферативной активности и морфологии ЦИКлимфоцитов после культивирования in vitroДля активации лимфоцитов и получения ЦИК использовали МНК 5больных меланомой и 5-ти больных ПКР и культивировали их 10-14 дней всреде X-vivo20 с добавлением IL-2 (250 МЕ/мл) и IL-15 (50 нг/мл).Показано, что при добавлении IL-15 к культуральной среде пролиферация лимфоцитов в первые трое суток культивирования была достоверно выше,чем в среде с одним IL-2 (рис.
31). При дальнейшем культивировании к 6-7дню активации наблюдалось незначительное увеличение пролиферативной ак155тивности и составило в среднем около 20%, а к 14 дню количество клеток увеличивалось на 100%, т.е. произошло удвоение популяции, чего не было достигнуто в среде c IL-2 (рис. 31).Рисунок 31. Влияние IL-2 и IL-15 на конфлюентность лимфоцитов больного.Также отмечено, что, используя комбинацию цитокинов IL-2 и IL-15жизнеспособность культивируемых клеток в суспензии несколько снижаласьи в среднем на 3 день составляла 100±0,7%, на 7 день - 96±2,6%, к 10 днюдостигла 93±2,2%, а к 14 дню – 89±5,2%. Как было показано ранее, жизнеспособность клеток в среде с IL-2 была несколько ниже.
Так на 3 день она в среднем составляла 98±1,5%, на 7 день снизилась до 93±2,0%, на 10 день былаоколо 89±3,0%, а на 14 день уменьшилась до 81±4,8% (p<0,05). По всей видимости, IL-15 обладает не только стимулирующим влиянием на пролиферациюлимфоцитов, но и способствует увеличению жизнеспособности клеток.Оценивая морфологию культивируемых лимфоцитов было замечено, что всреде с двумя цитокинами клетки меняют свою форму чуть позже, чем в среде сIL-2, начиная с 3 дня активации и сохраняют морфологию больших гранулярныхлимфоцитов на протяжении всего периода выращивания (рис. 32а).156баРисунок 32. Морфология лимфоцитов через 5 дней (а) и 10 дней (б) культивированияв среде с IL-2 и IL-15. Без окраски. Ув.: х400.При выращивании МНК было замечено, что лимфоциты в среде с двумяцитокинами начинают терять адгезионные свойства только после 10 дня культивирования, а в среде с одним IL-2 уже после 7 дня, что является неблагоприятным признаком для любых клеточных культур (рис.
32б). Оценка фенотипаклеток (не более 5-7%) с адгезивными свойствами среди АЦЛ, которые утратили таковые в среде с IL-2 к 8 дню культивирования, а в среде IL-2 и IL-15 к11 дню, показала, что половину этих клеток составляют дендритные клетки(более 52%), а также некоторое количество Т-лимфоцитов (около 30%) и NKклеток (около 18%), макрофагов в субпопуляции адгезирующих к пластикуклеток обнаружено не было. Переход клеток в суспензию может означатьокончание процесса активации данного вида клеток.4.2.2.
Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов и экспрессии активирующих рецепторов после культивирования in vitroДля определения субпопуляционного состава и маркеров активации лимфоцитов, культивируемых в среде с IL-2 и IL-15, было проведено фенотипирование CD45+ клеток периферической крови и суспензионных ЦИК-клеток на 0, 3, 6и 14 день культивирования у 5 больных ПКР. Оценивая фенотип лимфоцитовбольных ПКР, также, как и у больных меланомой, было выявлено повышенноесодержание регуляторных Тreg и CD25+ клеток в периферической крови.
У 75%больных отмечалось увеличение количества NK-клеток. Относительное содержание активированных HLA-DR+ лимфоцитов в среднем составило 19,3±6,1%,157что сопоставимо со значениями показателя у больных КРР и меланомой. Экспрессия CD38+ клеток составила 29,7±17,0%, что схоже с пациентами из группыКРР и ниже, чем у больных меланомой. Маркер активации CD69 экспрессировался на 20,2±22,1% лимфоцитах, как и у больных КРР и несколько выше, чем убольных меланомой. Среднее содержание рецептора NKG2D на всех лимфоцитах составило 45,7±16,6%, а на NK-клетках – 21,5±14,5%, что также сопоставимос больными КРР и несколько выше, чем у больных меланомой.При культивировании клеток в среде с IL-2 и при добавлении двух цитокинов IL-2 и IL-15 было выявлено, что в процессе активации в данных условияхпроисходит незначительное перераспределение клеточных субпопуляций.
Количество В- и Т-лимфоцитов незначительно уменьшается к 14 дню культивирования. Однако значимо увеличилось количество NK-клеток на 49,4% и активированных лимфоцитов, среди которых в большей степени увеличилась экспрессияHLA-DR на 183,3%, CD69 на 97,1%, CD25 на 58% и в меньшей степени увеличилась экспрессия CD38 на 37,9% и NKG2D на 28,9% (p<0,05) (рис. 33).B-кл.CD69+NK-кл*CD69+Т-кл. *CD69 ****CD38+Т-кл.
*Т-кл.ТhCD4+CD25+*****CD38400350300250200150*100500******CD25 (IL2ɑ)HLA-DR*CTL**NK-кл.NKG2DNKG2D+NK*HLA-DR+Т-кл.без ILс IL-2с IL-2 и IL-15Рисунок 33. Изменение поверхностной экспрессии маркеров активации на культивируемых лимфоцитах больных ПКР сразу после выделения (100%) и через 3 дня всреде с одним IL-2 и при совместном культивировании с IL-2 и IL-15.* различия показателей статистически достоверны (p<0,05).158В пуле АЦЛ процент СD25+ клеток максимально возрастал в 1,7 разтолько к 14 дню.
Количество NK-клеток к 5 дню возрастало в 1,4 раза и составляло в среднем 41,3±19% против 32,9±11% в среде только с IL-2. Количество CD4+CD25+ увеличивалось к 14 дню в 1,7 раз. Следует отметить, что доляТreg не изменилась на протяжении всего времени культивирования в данныхусловиях как с IL-2, так и с двумя интерлейкинами, что подтверждает данныедругих исследователей [84]. Доля CTL незначительно увеличилась в среднемс 37,4±8,9% до 41,2±20% по сравнению с культивированием в среде только сIL-2. Количество NKT-клеток в большей степени начинало увеличиваться ужепосле 3 дня культивирования с двумя интерлейкинами и к 6 дню их доля составляла в среднем 14%. Увеличение количества и активация NKT-клеток может значительно усилить их цитотоксический потенциал.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
